血液科一区顶刊：流式细胞术急性淋巴细胞白血病的预后选题思路热

　　前言
　　临床上，B系和T系急性淋巴细胞白血病（BTALL）的常规治疗策略为联合化疗，虽然近年来嵌合抗原受体T细胞（CART）疗法取得了显著效果，但部分ALL仍呈难治性，而且治疗后复发的风险较高，5年生存率仅为68。8左右。研究发现，ALL治疗耐受的原因或可系抗白血病宿主免疫所致，其中抗白血病自然杀伤（NK）细胞扮演了重要角色。作为效应细胞毒性淋巴细胞，NK细胞较CART细胞有着多种先天优势，或可成为免疫细胞疗法的热门研究对象。
　　为了进一步发展基于NK细胞的ALL治疗方案，来自美国斯坦福大学医学院的CarolineDuault、AnilKumar教授课题组在Blood期刊（IF：25。476）发表了题为的研究成果，通过流式细胞术研究方法，比较了健康人群与BTALL患者的NK细胞在免疫表型和功能性上的差异。发现了NK细胞分析作为预测急性淋巴细胞白血病患者临床结果的诊断工具的好处，并强调了同种异体NK细胞输注预防急性淋巴细胞复发的临床潜力。
　　研究思路
　　研究结果
　　1。NK细胞频率和细胞毒性在BTALL患者中降低
　　通过比较了BTALL患者和健康供体之间CD56NK细胞的频率，在控制CD14或CD33骨髓细胞，CD3TNKT细胞以及CD19或CD20B细胞后。与小鼠ALL中报告的NK细胞数量减少一致，与健康供体相比，ALL患者的非恶性免疫部分内的NK细胞频率显著降低（图1AB）。患者和健康供体之间NK细胞活力和增殖的差异不存在，表明BTALL中的NK细胞频率可能由其他机制降低。
　　图1NK细胞频率和细胞毒性在高风险BTALL患者中降低
　　2。具有细胞毒性较小的CD56分子特征的NK细胞在BTALL中扩增
　　所有NK细胞的细胞毒性降低表明，所有患者中细胞溶解性NK效应细胞的产生均受干扰。因此，作者假设CD56和CD56的NK细胞的频率在ALL中受到干扰。
　　使用CIBERSORT，作者将NK细胞的相对频率与CD56和CD56暗的分子特征进行比较。在诊断时测量来自COG和MILE的患者样本的转录组。与急性淋巴细胞毒性降低的急性淋巴细胞毒性一致，作者发现具有CD56光分子特征的NK细胞的频率增加，而具有CD56暗特征的NK细胞的频率降低，在BTALL中（图2B）。
　　图2具有细胞毒性较小的CD56分子特征的NK细胞在BTALL中扩增
　　所与健康供体相比，来自BTALL患者的PBMC中的CD56和CD56NK细胞频率保持不变，尽管CIBERSORT显示具有CD56NK细胞转录组的细胞在ALL中富集（图2B）。CD27和CD56的共表达表明，大多数CD56NK细胞是CD27，分化成CD56细胞毒性效应子导致CD27丢失。作者发现患者中细胞毒性最低的CD56CD27NK细胞分数显著增加，并且BMMC中细胞毒性CD56dimCD27NK细胞亚群随之减少，但在PBMC中则不然（图2CF）。
　　BMMCs中未成熟CD56CD27和CD27NKp46NK细胞的增加证实了所有患者中细胞毒性较小的CD56NK细胞的扩增（图2CD；补充图5AB，6A，C）。对于PBMC，尽管所有NK细胞中的CD56，CD27或NKp46没有扰动（图2EF；补充图5CD和6B，D），但作者观察到NK细胞的细胞毒性降低，并且具有CD56转录组的NK细胞被富集（图1CD，2B）。因此，作者推断来自急性淋巴细胞（ALL）患者的PBMC中的NK细胞表现出CD56特征。
　　3。NK细胞成熟为细胞毒性效应子在BTALL患者的PBMC中受到干扰
　　BTALL患者中细胞毒性最强的CD56dimCD94低亚群的频率显著降低（图3AB）。抑制性受体KIR2DL1（CD56NK细胞比CD56NK细胞表达更多）在总细胞中也减少，CD56在所有NK细胞中也减少（图3CD）。研究数据表明，产生细胞毒性NK效应细胞的途径在急性淋巴细胞中受到干扰。NK效应器成熟是一个4阶段的过程。
　　最后，比较所有患者和健康供体中细胞毒性诱导激活受体DNAM1的表达，与健康供体相比，患者DNAM1总NK细胞减少的趋势，细胞毒性最强的CD56dimDNAM1NK细胞的频率显著降低，以及CD56dimDNAM1细胞毒性部分增加的趋势（图3GH）。由于CD56dimDNAM1NK细胞是细胞毒性最大的NK细胞部分，研究结果表明，急性淋巴细胞白血病患者的NK细胞成熟缺陷。从CD56到CD56NK亚群的NK效应器成熟中的扰动导致BTALL患者中功能失调的NK细胞的积累。
　　图3NK细胞成熟为细胞毒性效应子在BTALL患者的PBMC中受到干扰
　　4。受刺激的所有NK细胞比健康细胞产生更多的细胞因子
　　CD56NK细胞在用PMA离子霉素或单因子刺激时，表达比CD56对应物更高水平的细胞因子干扰素（IFN），肿瘤坏死因子（TNF）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）。由于CD56状NK细胞在BTALL中增加（图2和3），作者预测受刺激的所有NK细胞将产生比正常对应物更多的细胞因子。因此，作者比较了BTALL患者和健康对照组中表达细胞内细胞因子的PMA离子霉素刺激的NK细胞亚群的频率。作者发现，与健康供体相比，BTALL患者的BMMC和PBMC中GMCSF和TNFNK细胞的频率增加。与健康个体相比，BTALL患者的IFNNK细胞在PBMC中显著增加，但在BMMC中保持不变（图4）。在急性淋巴细胞白血病患者中，PBMC和BMMC的CD56NK细胞部分中，MIP1和白细胞介素2（IL2）细胞分别显著增加。因此，受刺激的所有NK细胞比其健康细胞产生更多的细胞因子，进一步证实了所有患者中未成熟，产生细胞因子和细胞毒性差的CD56状NK细胞的扩增。
　　图4BTALL患者中受刺激的NK细胞比健康患者产生更多的细胞因子。
　　5。过度活化和疲惫的NK细胞积聚在急性淋巴细胞白血病患者的外周血中
　　研究发现与健康供体相比，ALL患者的受刺激PBMCNK细胞部分的CD107a细胞显著增加，证实了ALL中CD56明亮状NK细胞的富集。细胞因子，裂解颗粒和CD107a的表达增加（图4）表明急性淋巴细胞白血病患者的PBMCNK细胞过度活化。通过流式细胞术比较ALL患者和健康供体的NK细胞中活化标志物CD6978和Ca2动员水平，作者观察到所有患者的总NK细胞和NK细胞亚群中CD69细胞显著增加（图5AB），并发现所有NK细胞表现出更高的钙通量（图5CD）。因此，所有NK细胞都比健康的NK细胞更活跃。
　　图5过度活化和疲惫的NK细胞积聚在急性淋巴细胞白血患者的外周血中
　　6。高频率的活化NK细胞预示着高风险BALL的临床预后较差
　　通过分析中枢神经系统（CNS）受累（CNS、CNS2或CNS3）的预后不良的BALL，作者发现激活的NK细胞频率越高，RFS越短（图6C）。然后，作者研究了在诱导治疗结束时（第29天）根据最小残留疾病（MRD）分类为MRD或MRD的患者，活化和静息NK细胞的频率是否可以独立预测患者的临床结果。作者观察到，在预后较差的MRD和预后较好的MRD患者中，激活的NK细胞的相对比例越高，预后越大的NK细胞相对比例越高，预后越大，结果越差，RFS就越短（图6D）。
　　将仅活化NK细胞和没有静息NK细胞（100活化NK，n85）的患者与没有活化NK细胞且仅静息NK细胞（100静息NK，n73）的患者进行比较，作者发现100活化NK细胞的患者预后比100静息NK细胞的患者更差（图6E）。最后，作者发现，活化的NK细胞的缺失独立地预测了BALL患者的CNS，MRD和MRD患者的有利临床结果（图6FG）。因此，活化的NK细胞分子特征的富集预示着急性淋巴细胞的临床结局较差，这与CNS受累或MRD状态无关。
　　图6高频率的活化NK细胞预示着高风险BALL的临床预后较差
　　7。CD56、CD69、钙信号传导和细胞因子在预后不良的所有患者中均增加
　　实验证实，仅活化NK细胞的COGBALL患者表达更高水平的NK细胞活化标志物，发现与100静息NK细胞和更好预后的对应物相比，ALL中的NK细胞活化标志物水平更高。100活化NK细胞患者的CD56和CD69转录本显著增加于100静息NK细胞的患者，使用基因集富集分析，研究表明Ca2信号传导在100活化的NK细胞组中显著上调。因此，具有100活化NK细胞的所有患者的预后不佳可能源于未成熟的慢性活化NK细胞反复失败以裂解淋巴细胞（图35）。
　　由于所有NK细胞在刺激时都可以产生更多的细胞因子（图4），假设GMCSF，TNF和IFN的高表达与CIBERSORT中活化的NK细胞的分子特征一致。为了测试这一点：
　　（1）研究比较了具有100活化NK细胞或100静息NK细胞的COGBALL患者中转基因脑脊液CSF2，TNFLTA，TNFCLTB和IFNIFNG的转录本水平。由于TNF的表达在COG中不可用，使用TNF和TNFC，它们也在受刺激的CD56NK细胞中诱导。在100活化的NK细胞与100静息NK细胞的患者中，GMCSF和TNF信使RNA显著增加，并且IFN增加的趋势（图7A）。
　　（2）根据转基因脑脊液、TNF和IFN的中位信使RNA表达，将COGBALL患者分为2组，如GMCSF高TNF高IFN高（n22）和GMCSF低TNF低IFN低（n19），并使用CIBERSORT估计这些组中活化和静息NK细胞的相对频率。GMCSF高TNF高IFN高组的患者活化NK细胞的频率高于GMCSF低TNF低IFN低组（图7B）。因此，CIBERSORT中活化的NK细胞的分子特征与经典的NK细胞活化标志物一致，包括细胞因子的产生增加。
　　图7产生细胞因子的NK细胞的高频预示着急性淋巴细胞的严重程度增加和预后较差
　　相关讨论
　　研究表明，NK细胞促进骨髓移植受者ALL的消退强调了NK细胞在抗白血病免疫监测中的作用。然而，NK细胞监测在人类急性淋巴细胞白血病中受到干扰的机制，以及NK细胞监测中的这些扰动是否预测了患者的临床结果，都是未知的。研究表明，急性淋巴细胞白血病患者中细胞毒性NK效应细胞的产生减少可能会降低NK细胞的细胞毒性。
　　研究发现具有临床相关性；过度激活的产生细胞因子的NK细胞预示着BTALL患者的不良结局，与预后因素（包括MRD和中枢神经系统受累）无关。作者发现，激活的产生细胞因子的NK细胞预示着儿童和成人急性淋巴细胞白血病的临床结果不佳。作者预计将将作者的研究结果转化为基于流式细胞术的血液或骨髓抽吸物NK细胞分析，以预测所有患者在诊断时的结果，并确定可以从NK细胞疗法中受益的患者。
　　研究结论
　　B细胞和T细胞急性淋巴细胞白血病（BTALL）可能在治疗后通过抑制由自然杀伤（NK）细胞特异性介导的宿主抗癌免疫监测而变得难治或复发。使用质谱细胞术、流式细胞术和计算机细胞术描绘了BTALL高危患者中NK细胞的表型和功能缺陷，进一步阐明了NK细胞在维持急性淋巴细胞白血病（ALL）消退中的作用。与正常细胞相比，来自BTALL患者的NK细胞毒性较小，但表现出以高CD56，高CD69，活性NK细胞起源细胞因子的产生和钙（Ca2）信号传导为特征的活化特征。因此，NK细胞的缺陷成熟成细胞毒性效应子可以防止来自ALL的NK细胞像正常NK细胞一样有效地裂解NK细胞敏感靶标。此外，ALL中的NK细胞已经耗尽，这可能是由它们的慢性活化引起的。产生细胞因子的活化NK细胞频率增加与疾病严重程度增加有关，并独立预测急性淋巴细胞白血病患者的不良临床结局。
　　小鹿推荐
　　文章利用质谱细胞术、流式细胞术和计算机细胞术描绘了BTALL高危患者中NK细胞的表型和功能缺陷，进一步阐明了NK细胞在维持急性淋巴细胞白血病（ALL）消退中的作用。强调了开发NK细胞分析作为预测急性淋巴细胞白血病患者临床结果的诊断工具的好处，并强调了同种异体NK细胞输注预防急性淋巴细胞复发的临床潜力。
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