运用转录组学联合靶向代谢组学技术揭示杜鹃叶片越冬新机制热博聚

　　前言
　　2022年1月，欧易鹿明生物合作客户浙江大学夏宜平教授课题组在HorticRes。期刊发表的题为“PhotoprotectioncontributestofreezingtoleranceasrevealedbyRNAseqprofilingofRhododendronleavesduringcoldacclimationanddeacclimationovertime”的研究成果，通过转录组学技术、靶向代谢组学技术研究方法，发现了杜鹃叶片通过光合作用和积累碳水化合物以及降低ABA、JA和木质素含量来获得抗冻性。
　　中文标题：通过对杜鹃叶片的RNAseq分析发现：在低温驯化和去低温驯化过程中光保护有助于提高杜鹃叶片的抗冻性
　　研究对象：植物叶片
　　发表期刊：HorticRes。
　　影响因子：6。793
　　发表时间：2022年1月
　　发表单位：浙江大学
　　运用生物技术：转录组学、靶向代谢组学（由鹿明生物提供技术支持）
　　研究背景
　　冷冻耐受（FT）是北温带植物的一项获得性能力。多年生的木本植物在秋冬两季较短的光周期和较低的温度下逐渐获得FT的过程称为“低温驯化”（CA），而植物在高温下逐渐失去获得的FT的过程称为“去低温驯化”（DA）。近年来，由于暖冬和非季节性气温变暖导致一些植物不完全的CA和未成熟的DA，而这种对寒冷的反应会给这些植物带来一系列的威胁。
　　早期研究仅仅关注CA的低温研究，然而温度的季节性变化常常伴随着光照的变化，单单研究温度变化限制了对CA过程的深入了解；研究者认识到这一点之后，开始关注光照对CA过程的影响。然而，DA作为一个很重要的过程，其研究却常常被忽略。
　　研究思路
　　研究结果
　　植物生长与叶片抗冻性（LFT）
　　图1中的a和b图展示了研究期间气温和光照变化。茎在11月初逐渐停止生长，直到3月才恢复生长（图1c）；花蕾在12月逐渐停止生长，次年2月恢复生长。结果表明，叶片出芽的时间与花芽恢复生长的时间基本一致，比茎恢复生长的时间提前约1个月。叶片耐受以LT（引起50叶片损伤的温度）表示，LT从09月27日至10月24日变化不大，但光周期缩短了0。8h；从10月24日至1月19日，随着温度和光周期的降低，叶片的抗冻性（LFT）开始增加，1到4月随着温度和光周期的增加，LFT逐渐降低。这些数据表明，在CA期间，随着茎的停止生长，LFT增加；而在DA期间，随着叶芽的出现以及花芽和茎的再生，LFT减少；开花后，叶片完全失去获得的LFT。
　　图1环境对植物生长的影响
　　植物的转录组测序
　　为了研究CA和DA整个过程，作者对所有的转录组学数据进行了PCA分析。通过时序比较，总计有25148个基因在至少其中一组中差异表达，其中有10435，8404，5201，6012和12386个差异基因分别属于1到5时期。对这5个时期做KEGG分析，发现在每一个时期都富集到“苯丙素的生物合成”，“MAPK信号通路植物”，“昼夜节律植物”等6条通路，表明这些过程在CA和DA都处于活跃阶段。
　　为了确定转录组学的时间特征，使用Mfuzz对18个样本的25148个差异转录基因（DET）进行聚类分析，将所有差异转录基因划分为10个聚类。选取每个聚类的显著富集的通路，并绘制热图。
　　聚类10中的DETs可能在冬季提供最强的LFT，因为其最高表达出现在LFT最强时。“生理节律”也富集在聚类10，同时也富集于聚类2、5、9。因此，“昼夜节律”通路可能代表时期2、3、5的不同变化，这三者对于CA或早期DA反应中获得LFT的过程都具有重要作用。
　　作者分析了每个聚类中与“昼夜节律”相关的DETs，发现标注为“cryptochrome1（CRY1）”和“bHLHPIF3”的DETs仅在聚类10中富集。因此，CRY1s和PIF3s的上调可能在叶片获得最强LFT中起重要作用。
　　图2杜鹃叶片的转录组学测序分析
　　基因共表达网络（WGCNA）及生理参数与DETs的关系
　　通过WGCNA分析探究DETs和生理参数，将DETs分为20个模块。三个模块（红色、蓝色、蓝绿色）的p值均小于0。01，接下来对他们做进一步分析。红色模块中，DETs从9月27日到1月19日分别上调和下调，而从1月19日到4月18日又分别下调和上调，这一模块的基因富集于“生理节律”，“ABC转运体”和“植物激素信号转导”；蓝色模块的基因从9月27日到11月28日分别上调和下调，并到1月19一直保持上升，再分别下调和上调，这些基因富集于“生理节律”等8个信号通路；在蓝绿色模块中，DETs从9月27日到11月9日分别快速下降和上升，并持续下降和上升到11月28日，而从3月20日到4月18日分别上升和下降，这些基因富集于“植物病原菌互作”等通路。基于这些分析表明“生理节律”是最显著富集的通路。
　　图3基因共表达及与生理参数的关系分析
　　通过靶向代谢组学分析发现，在蓝绿色模块中，“淀粉和蔗糖代谢”与碳水化合物代谢有关，“亚麻酸代谢”和“亚油酸代谢”是JA生物合成的上游，“类胡萝卜素生物合成”是脱落酸（ABA）生物合成的上游，“苯丙素生物合成”是木质素生物合成的上游。因此，对6个时间点的碳水化合物（葡萄糖、果糖和蔗糖）、ABA、JA和木质素含量进行检测。果糖和葡萄糖与红色模块高度相关，蔗糖与蓝色模块高度相关，ABA、JA、肉桂酸、阿魏酸和芥子酸的含量与蓝绿色模块高度相关，无模块与对香豆酸相关。由于红色、蓝色和蓝绿色模块与LT高度相关，那么葡萄糖、果糖、蔗糖、ABA、JA和木质素含量也与LT值相关。同时，“生理节律”在红色和蓝色模块都最显著富集，显示了其与糖的相关性。而ABA、JA和木质素含量和蓝绿色模块显示了最强的相关性。以上结果说明了糖与“生理节律”，ABA，JA与木质素之间在CA和DA时期的相互作用。
　　图4糖（a）、脱落酸（b）、茉莉酸（c）、肉桂酸（d）、对香豆酸（e）、阿魏酸（f）和芥子酸（g）在CA和DA期间的含量变化
　　探究光保护与昼夜节律的关系
　　作者运用超微结构透射电子显微镜探究光保护相关的DETs与昼夜节律相关的基因共表达，提示CA和DA期间可能存在光保护与昼夜节律的关系。此外，叶绿体超微结构显示：作者发现了颗粒堆积的大量损失和类囊体的脱落，同时发现叶绿体在光照强度为80molms、每天14h、22下，6天恢复。
　　图5通过叶绿素荧光（a，b，c，d）和叶绿素超微结构透射电子显微照片（e，f）研究了“miyonosakae”杜鹃越冬叶片PSII光化学性能的季节动态
　　CA和DA过程中ABA、JA和木质素相关基因的变化
　　从香叶酰二磷酸到紫黄质，大多数DETs在高表达，两种分解ABA的酶UDP葡萄糖转移酶和ABA8羟化酶低表达。ABA信号转导中，PYLs多在高表达，PP2Cs和SnRK2s多高表达。大部分PP2Cs和SnRK2s的变化趋势与ABA含量的变化趋势一致。与JA生物合成相关的DETs变化与JA含量变化基本一致；与JA分解代谢相关的DETs的表达量与JA含量相反。
　　此外，“叶绿体包膜醌氧化还原酶（QORH）”和“PsbP”的DETs在JA生物合成途径“亚麻酸代谢”中富集，并呈现高表达。QORH位于叶绿体包膜的内膜，可以使多不饱和脂肪酸过氧化物的产物解毒。PsbP是PSII的一个外源性亚基，参与光合作用水氧化的正常功能。在JA信号中，除COIs高表达外，大部分JAZs和MYC2s的DETs的变化趋势与JA内容相似，CA过程中ABA和JA含量的季节变化与之前对“ElsieLee”杜鹃越冬叶的研究结果一致。
　　虽然“苯丙氨酸解氨酶（PAL）”和“肉桂酸4单加氧酶（C4H）”的DETs高表达，肉桂酸和对香豆酸的含量有所下降。这表明，肉桂酸和对香豆酸在CA的转录水平上没有受到调控。对香豆酸、阿佛酸和芥子酸是对香豆醇、针叶树醇和芥子醇三种单木质素的前体，阿魏酸和芥子酸含量大幅下降。“4香豆酸辅酶a连接酶（4CL）”、“肉桂酰辅酶a还原酶（CCR）”、“肉桂醇脱氢酶（CAD）”和“过氧化物酶（PRX）”参与木质素的生物合成。
　　过氧化物酶催化是H、G或S木质素形成的最后一步，PRXs在CA和DA过程中没有明显的变化趋势。此外，16个BGLUs中有10个在CA期间下调，在DA期间上调。BGLUs能水解针叶树蛋白，释放出针叶树醇。针叶醇是针叶醇的4o葡萄糖苷，被认为是单醇的一种运输或储存形式。BGLU和PRX是木质素生物合成的最后一个步骤，都发生在细胞壁中。
　　图6脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和木质素途径
　　研究结论
　　结合前期成果，本研究发现昼夜节律可能在杜鹃花叶片冬季获得LFT过程中发挥关键作用。WGCNA分析揭示某些昼夜节律相关基因在CA过程中上调，在DA过程中下调，可能分别与糖的积累和分解代谢有关。在CA期间，两种杜鹃越冬叶片ABA和JA含量均有所下降，直到完全丧失LFT后才恢复。LFT与ABA或JA含量的负相性与其他组织（如芽和茎）或其他植物（如拟南芥和水稻）的负相性有很大的不同。其原因可能是在野外环境下，CA的诱导光保护作用。冬季ABA和JA生物合成的降低可能导致木质素含量的降低。因此，作者提出，在野外条件CA的低温和强光胁迫下，越冬叶片获取LFT的机制是独特的。这是通过光合作用和积累碳水化合物以及ABA、JA和木质素含量的降低来实现的。
　　小鹿推荐
　　在本研究中，研究者通过转录组学、靶向代谢组学技术发现了杜鹃越冬时，叶片获取LFT的独特机制。同时靶向代谢组学技术，已经作为一种较为成熟的研究手段，可以对我们前期关注的代谢物进行分析，作为非靶向代谢组学技术的一种补充和证明。提供多种代谢组学检测服务，包括LCMS非靶向代谢组学技术、GCMS非靶向代谢组学技术、脂质组学技术和空间代谢组学。
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　　本文系鹿明生物原创