山东大学运用多组学解析人参固本口服液对甲状腺毒症的抗衰老作用

　　前言
　　2022年10月25日，鲁南制药联合山东大学在FrontiersinImmunology期刊发表的题为“TheantiagingeffectsofRenshenGubenonthyrotoxicosismice：Improvingimmunosenescence，hypoproteinemia，lipotoxicity，andintestinalflora”的研究成果，鲁南制药集团冯芹博士为第一作者，鲁南制药集团张贵民研究员和山东大学齐鲁医院刘德山教授为共同通讯作者。研究采用流式细胞技术、蛋白质组学，粪便代谢物学、植物代谢组学和微生物组学等研究方法，研究人参固本（RSGB）口服液对甲状腺毒症加速衰老小鼠模型的影响。
　　结果表明，RSGB恢复了中性粒细胞和淋巴细胞的数量，增强了淋巴细胞的功能，提高了补体和抗菌肽的水平，表明RSGB在细胞和分子水平上提高了甲状腺毒症小鼠的免疫力。RSGB通过改善贫血、低白蛋白血症、离子转运蛋白和维生素结合蛋白来纠正甲状腺毒症小鼠的营养不良。
　　RSGB通过提高胆汁酸和肠道乳酸菌水平增强了甲状腺毒症小鼠的肠道防御能力。植物代谢组学分析表明，RSGB口服液和含药血清中含有多种活性成分，包括萜类、酚酸、黄酮类、单宁、生物碱、有机酸、酚胺、氨基酸等，它们具有抗氧化、免疫调节和抗衰老作用，是RSGB的物质基础。
　　总体而言，RSGB通过改善免疫衰老、低蛋白血症、脂毒性和肠道菌群对抗甲状腺毒症小鼠的加速衰老，本研究表明RSGB系统的抗衰老作用将有利于改善老年人的疾病易感性和预后。
　　中文标题：人参固本对甲状腺素毒症小鼠的抗衰老作用：改善免疫衰老、低蛋白血症、脂毒性和肠道菌群
　　研究对象：小鼠
　　发表期刊：FrontiersinImmunology
　　影响因子：8。786
　　发表时间：2022年10月25日
　　合作单位：鲁南制药集团，山东大学齐鲁医院
　　运用组学技术：流式细胞技术、蛋白质组学，粪便代谢物学、植物代谢组学和微生物组学，蛋白组学和代谢组学
　　研究背景
　　老龄化问题的核心是疾病易感性和预后不良的增加，而复杂的药物治疗也会增加这种风险。因此，维护自我恢复能力是保护老年人的有效科学策略。循环系统中有各种细胞、蛋白质和代谢物，对维持机体正常的生理功能具有重要意义。免疫细胞和免疫分子水平的减少反映了机体储备功能的下降，这是导致老年人对疾病的抵抗力下降的原因。低蛋白血症会导致代谢废物的运输和清除受损，代谢废物积聚产生的毒性如脂毒性会导致衰老。而肠道菌群的失衡也会导致许多与年龄相关的退行性疾病和不健康的衰老。
　　人参固本口服液（RSGB）是著名的经典方剂，具有强身健体、恢复元气的作用。人参固本口服液处方包括人参、生地黄、熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓、麦冬、天冬，这些中药由于其经久不衰的使用和众所周知的功效被列入中国药典，其药理作用，尤其是抗衰老作用，已被广泛研究，他们的联合处方RSGB将具有超强的抗衰老作用。
　　虽然根据中医理论，RSGB在临床上有广泛的应用，但现代医学理论中的作用机制和有效成分仍不清楚。作者前期的研究发现，甲状腺毒症小鼠模型具有免疫衰老、营养不良、脂毒性等特点，可被认定为抗衰老药物筛选的加速衰老模型。本文采用甲状腺素毒症加速衰老小鼠模型从免疫、营养、代谢和肠道菌群等方面研究了RSGB口服液对甲状腺毒症小鼠的抗衰老作用。本研究将血常规、生化、流式细胞仪、蛋白质组学、代谢组学、微生物组学和植物代谢组学相结合，阐明RSGB的作用机制和物质基础。
　　研究思路
　　研究结果
　　1。RSGB逆转甲状腺毒症小鼠粒细胞缺乏症
　　血常规检测结果显示，给与过量甲状腺素10天后，白细胞（WBC）、中性粒细胞（NEUT）和淋巴细胞（LYMPH）明显减少。高剂量的RSGB增加了甲状腺毒症小鼠的WBC，而低中高剂量（5，10，20mlkg每天1次，连续20天）的RSGB均增加了NEUT（图1A），这表明RSGB可以逆转甲状腺毒症小鼠的粒细胞缺乏症。
　　2。RSGB减轻甲状腺毒症小鼠白细胞减少和贫血
　　血常规检测结果显示，给与过量甲状腺素20天后，全血细胞明显减少。血常规检测结果显示，RSGB治疗（5mlkg每天2次，连续30天）使甲状腺毒症小鼠的降低的WBC、NEUT、LYMPH和嗜酸性粒细胞均显著升高（图1B），这表明RSGB逆转了白细胞减少。RSGB治疗组的红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血细胞比容（HCT）和RDWSD也增加（图1C），这表明RSGB减轻了甲状腺毒症小鼠的贫血。RSGB治疗组的血小板计数（PLT）也增加（图1D），这表明RSGB可以预防甲状腺毒症小鼠的血小板减少症。尽管RSGB处理的小鼠和甲状腺毒症小鼠之间的网织红细胞计数有增加趋势（图1E），而且RSGB治疗组低荧光强度网织红细胞增加，而高荧光强度网织红细胞减少，未成熟网织红细胞分数降低，表明RSGB治疗通过促进了甲状腺毒症小鼠红细胞成熟而减轻贫血（图1F）。
　　3。RSGB改善甲状腺毒症小鼠低蛋白血症
　　生化检测显示，RSGB治疗组总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）和球蛋白（GLB）水平显著升高，表明RSGB治疗改善了甲状腺毒症小鼠的低蛋白血症和低白蛋白血症（图1G）。
　　4。RSGB增强甲状腺毒症小鼠淋巴细胞功能
　　流式细胞术的结果表明，RSGB治疗显著增加了甲状腺毒症小鼠中CD4CD8的比率和CD3CD4IFN的百分比（图1H）。说明RSGB改善了免疫衰老，恢复了淋巴细胞的功能。
　　图1人参固本（RSGB）对甲状腺毒症小鼠血细胞计数、淋巴细胞亚群和功能、生化指标的影响
　　a）RSGB处理（5、10和20mlkg，每天一次，20天）显著增加了中性粒细胞。
　　b）RSGB处理（5mlkg，每天两次，30天）显著增加了甲状腺毒症小鼠的白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞。
　　c）RSGB治疗恢复了红细胞（RBC）、血红蛋白、血细胞比容和RDWSD，这表明RSGB可以改善甲状腺毒症小鼠的贫血。
　　d）RSGB治疗增加了血小板计数。
　　e）网织红细胞计数表明，RSGB治疗促进了甲状腺毒症小鼠的红细胞成熟。
　　f）网织红细胞计数表明，RSGB治疗减轻了贫血。
　　g）RSGB治疗显著增加了甲状腺毒症小鼠的总蛋白、白蛋白和球蛋白水平，这表明RSGB治疗改善了甲状腺毒症小鼠的低蛋白血症。
　　h）RSGB治疗增加了CD4CD8的比例和CD3CD4IFN的百分比，这表明RSGB改善了甲状腺毒症小鼠的免疫衰老。
　　5。血清蛋白质组学分析
　　主成分分析显示，甲状腺毒症小鼠（V）和RSGB治疗小鼠（L）之间存在显著差异，蛋白质组学分析突出了两组之间的36个DEP。两种下调的蛋白质是Cycs和Apoc3。通过Metascape在线分析了34种上调的蛋白质并进行通路富集（图2B）。
　　STRING显示上调DEP的详细信息（图2C）。在这些上调的蛋白质中，12个与防御反应有关，10个与免疫反应有关，3个为抗菌肽，这表明RSGB处理增加了防御能力。
　　相关性分析表明，下调的DEPsApoc3和Cycs与大多数上调的DEPs呈负相关。Alb与大多数上调的DEP呈正相关（图2D）。表明RSGB治疗显著改善了甲状腺毒症小鼠的低白蛋白血症。综上所述，血清蛋白质组学结果表明，RSGB治疗显著改善了甲状腺毒症小鼠的防御能力和营养不良。
　　图2人参固本（RSGB）对甲状腺毒症小鼠血清蛋白质组的影响
　　a）甲状腺毒症小鼠（V）和RSGB治疗小鼠（L）之间有36种差异表达蛋白（DEP）：2种下调，34种上调。
　　b）Metascape在线分析共分析了34种上调的蛋白质。
　　c）STRING在线分析（https：stringdb。org）显示了上调的DEP集群。
　　d）DEP的相关性分析。红色为正相关，蓝色为负相关。
　　6。血清和粪便中的LCMS代谢组学分析
　　血清代谢组学分析结果显示，RSGB治疗组（L）和甲状腺毒症组（V）的OPLSDA评分存在显著差异（图3A）。热图显示了一些DEM的丰度（图3B）。基于Lipidmaps（v2。3）数据库，筛选了RSGB治疗小鼠血清中的163个脂质DEP（图2B）。
　　粪便代谢组学分析结果显示，RSGB治疗组（L）和甲状腺毒症组（V）的OPLSDA评分存在显著差异（图3D）。在RSGB处理的小鼠的粪便中，胆汁酸类显著上调（图3E）。（胆汁酸、氨基酸和蛋白质合成代谢示意图见图3F）
　　图3人参固本（RSGB）对甲状腺毒症小鼠血清和粪便代谢组的影响
　　a）血清代谢组学分析结果显示，RSGB治疗组（L）和溶媒对照组（V）的OPLSDA评分存在显著差异。
　　b）热图显示，在RSGB治疗组中，氨基酸、肽和类似物类别中的血清差异表达蛋白（DEP）被下调。
　　c）热图显示血清中脂质组学的结果，脂毒性代谢产物显著下调，保护性脂类DPA和胆汁酸水平显著上调。
　　d）粪便代谢组学分析结果显示，RSGB治疗组（L）和溶媒对照组（V）的OPLSDA评分存在显著差异。
　　e）粪便代谢组学表明粪便中的氨基酸二肽显著下降，胆汁酸水平显著升高。
　　f）胆汁酸、氨基酸和蛋白质合成代谢示意图，胆汁酸合成和肠道转化增加，蛋白合成增加，氨基酸、二肽的丢失减少。
　　7。粪便中微生物组变化及其与RSGB代谢物的相关性
　　LEfSe显示了每组中丰度相对较高的物种（图4A）。在门、纲、目、科、属和种水平上具有显著差异的微生物丰度如图4B所示。在RSGB处理组的粪便中检测到大量RSGB代谢物，包括三萜类、萜内酯、萜苷、甾醇、黄酮类和环丁烷木脂素（图4C）。相关性分析显示，几种RSGB代谢物与肠道微生物呈正相关，尤其是人参代谢物和乳酸杆菌（图4D）。
　　图4人参固本（RSGB）对甲状腺毒症小鼠粪便微生物组的影响及微生物组与RSGB代谢物的相关性
　　a）LEfSe显示每组中丰度相对较高的物种。
　　b）在门、纲、目、科、属和种水平上存在显著差异的微生物丰度。
　　c）RSGB治疗小鼠粪便中的RSGB代谢物。
　　d）RSGB处理组粪便中微生物组与RSGB代谢物的相关性。
　　8。RSGB口服液的安全性
　　对RSGB口服液（20mlkg，W）治疗30天的安全性进行了研究。与正常对照小鼠（N）相比，RSGB单独治疗组的生化测试中仅发现TG和LDLC降低。WBC、NEUT和LYMPH在血常规检查中略有升高属正常水平，为药效作用的扩展，其他指标没有差异，表明RSGB口服液长期给药30天无毒性反应，证明了RSGB口服液的安全性。
　　9。RSGB口服液和含药血清中的活性成分
　　对植物代谢组学显示，通过LCMSMS对RSGB口服液（R）和含药血清（L）共鉴定和定量了121种植物成分（图5A）。在药物和含药血清中含量较高的酚酸包括原儿茶酸、咖啡酸、异阿魏酸、水杨酸、香草酸、4羟基苯甲醛和阿魏酸（图5B）。在RSGB口服液和含药血清中均检测到黄芩苷和多种槲皮素衍生物（图5C）。生物碱包括胆碱和多种核苷（图5D）。单宁主要是鞣花酸、没食子酸及其衍生物（图5F）。有四种酚胺，N阿魏酰尸胺、N阿魏酰羟基腐胺、对香豆酰酪胺和N阿魏酰酪胺（图5G）。RSGB口服液和含药血清中含有大量氨基酸和有机酸（图5H，I）。含药血清中杜仲醇和阿亚平的丰度相对较高（图5J）。这些物质可能是RSGB口服液药理作用的物质基础。
　　图5人参固本（RSGB）口服液和含药血清的成分
　　a）在RSGB口服液（R）和含药血清（L）中共鉴定出121种植物成分，其中b）酚酸30种、c）黄酮类17种、d）生物碱16种、e）萜类化合物14种、f）单宁12种、g）酚胺4种、h）氨基酸12种、i）有机酸9种、j）其他7种。
　　10。RSGB机制示意图
　　如图6所示。RSGB治疗通过上调Alb、Ttr和功能蛋白显著改善了甲状腺毒症小鼠的低蛋白血症。上述功能蛋白的恢复不仅表明营养不良得到了改善，而且有利于维持防御能力。RSGB治疗通过降低脂毒性来改善免疫衰老。RSGB通过降低脂毒性脂质和脂质样分子（如游离脂肪酸、甘油三酯、鞘脂和糖皮质激素）的水平来减轻脂毒性。此外，RSGB中众多具有优异抗氧化活性的活性成分具有直接的抗脂毒性作用。保护性类脂分子DPA、维生素D3和胆汁酸水平的增加有助于提高防御能力，RSGB还上调了乳酸菌。
　　图6RSGB作用机制
　　研究结论
　　随着年龄的增长，机体的免疫功能逐渐下降，导致易患传染病、肿瘤、自身免疫病和一些老年疾病。衰老除了免疫力外，还表现在生理、生化、新陈代谢、内分泌、器官等各个方面，这些方面相互影响，所以衰老是一系列事件的叠加效应。可以对这些事件做出反应的衰老模型具有很大的科学意义，而对这些方面有影响的药物将具有巨大的抗衰老潜力。作者之前的研究表明，甲状腺毒症小鼠模型就是这样一种模型。在该模型中，生理方面全血细胞总数减少，生化方面TP和Alb降低，免疫方面免疫细胞数量和功能降低，补体水平降低。所有这些表现都与衰老和衰老相关疾病有关。本研究在甲状腺毒症小鼠模型上证实了中药方剂RSGB的抗衰老作用，并对其抗衰老机制进行了充分探索。
　　总体而言，RSGB从以下几个方面改善了甲状腺毒症小鼠的衰老特征：增加免疫细胞数量和功能，提高免疫分子水平，降低脂毒性，改善营养状况，调节肠道菌群。
　　本研究验证了RSGB对甲状腺毒症小鼠的抗衰老作用，并阐明了其作用机制和物质基础。除了通过测试血液指标获得的抗衰老效果外，鉴于RSGB成分的多重保护作用，推测RSGB可能还具有器官保护作用，接下来的研究将验证器官保护作用，以更充分地证明RSGB的抗衰老作用。长期以来，中医药多要素、多效的系统治疗策略为保障国人健康发挥了重要作用，相信随着对中医药的不断研究和认识，未来在保障全球人类健康方面也将发挥更大的作用。
　　小鹿推荐
　　本研究采用常规检测方法结合多组学技术，研究人参固本（RSGB）口服液对甲亢加速衰老小鼠模型的影响。对于血液和血清，文章采用了流式细胞确定免疫衰老表型，采用生化检验和蛋白组学确定脂质的代谢变化。采用植物代谢组学解析特有代谢产物。文章还利用关联分析技术，挖掘和归纳作用机制。文章为中药的现代化研究提供路线，为中药的临床应用价值挖掘提供思路，值得借鉴和推广。
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