运用全转录组测序发现lncRNA可以调控结直肠癌抵抗热传聚热

　　前言
　　结直肠癌（CRC）是一种常见的胃肠道恶性肿瘤，位居全球恶性肿瘤发病率第三。目前已有证据表明术后放疗可以减少局部复发、提高生存率。然而，在临床实践中，对放疗敏感性的个体差异很大，因此寻找新的生物标志物来预测放疗敏感性，制定个性化策略具有十分重要的意义。
　　2022年8月17日，苏州大学附属第三医院（常州市第一人民医院）蒋敬庭教授为通讯作者，在CellDeathDifferentiation（IF：12。067）杂志上在线发表题为“AnovellongnoncodingRNASP100AS1inducesradioresistanceofcolorectalcancerviaspongingmiR622andstabilizingATG3”的研究论文，发现了lncRNASP100AS1在调节CRC细胞增殖和放射敏感性中的作用，为探索CRC潜在的生物标志物及其可能的调控机制提供参考。
　　技术路线
　　研究结果
　　1、SP100AS1上调表达与CRC放疗抵抗相关
　　通过全转录组测序分析了放疗敏感和放疗抵抗患者的lncRNA表达谱变化，发现lncRNASP100AS1在放疗抵抗患者中显著高表达（图1）。与正常上皮细胞系相比，SP100AS1在CRC细胞系中显著高表达，尤其是HCT116和SW480。此外发现SP100AS1高表达的CRC患者的总生存率偏低（图1）。综上所述，lncRNASP100AS1高表达与CRC患者的放疗抵抗和低生存率相关。
　　图1SP100AS1在结直肠癌中高表达
　　2、SP100AS1敲除增强了CRC的放疗敏感性
　　作者探究了SP100AS1对CRC细胞增殖和放疗敏感性的影响。抑制SP100AS1表达时，HCT116和SW480细胞的放疗敏感性显著增加，细胞增殖水平和细胞活力显著下降，并且诱导了DNA损伤的重要标志物H2AX的表达，显著增加了HCT116细胞的凋亡（图2）。SP100AS1参与了辐射诱导的DNA损伤和细胞凋亡，且SP100AS1敲除可提高CRC的放疗敏感性。
　　图2SP100AS1敲除加剧了放疗诱导的细胞死亡
　　3、SP100AS1在体内具有显著的放疗抵抗性
　　裸鼠移植瘤实验表明，SP100AS1敲除的HCT116细胞生长较慢，且在2Gy辐射下，SP100AS1敲除的HCT116细胞生长更为缓慢（图3）。在2Gy辐射下，敲除SP100AS1会诱导更严重的DNA损伤，表明SP100AS1敲除抑制了CRC肿瘤细胞的生长，特别是在辐射暴露下（图3）。综上，SP100AS1敲除可以提高CRC的体内外放疗敏感性。
　　图3SP100AS1敲除抑制CRC细胞生长
　　4、SP100AS1通过自噬途径增加结肠直肠癌细胞的放疗抵抗活性
　　为了探究自噬途径是否参与了抗辐射过程，作者分析了LC3II和p62SQSTM1等蛋白在敲除SP100AS1细胞系中的表达情况。敲除SP100AS1后，LC3II表达下调，p62表达上调；放疗处理后，LC3II表达下调，p62表达上调，说明自噬作用明显减弱（图4）。WB和IHC分析表明，IR治疗后的CRC移植瘤中p62表达显著降低，LC3II表达显著升高，而SP100AS1敲除逆转了这一趋势。综上，辐射可以诱导HCT116细胞的自噬，而敲除SP100AS1则可以缓解这一作用。
　　图4SP100AS1通过自噬调控HCT116细胞增殖
　　5、SP100AS1通过ATG5和Beclin1调控自噬通路
　　有报道称ATG5和Beclin1可直接激活自噬信号通路，因此作者探究了过表达ATG5和Beclin1能否挽救SP100AS1介导的自噬。回复实验表明：因SP100AS1敲除所诱导的自噬下调可以通过上调ATG5或Beclin1来挽救（图5）。此外，上调ATG5和Beclin1，可以降低SP100AS1敲除诱导的细胞凋亡（图5）。这些结果表明，ATG5或Beclin1的上调，都可以挽救因SP100AS1下调导致的细胞增殖下降。
　　图5过表达ATG5和Beclin1均挽救了SP100AS1介导的自噬
　　6、SP100AS1与ATG3相互作用并调节其蛋白稳定性
　　通过质谱鉴定和pulldown找到了一个可以与SP100AS1特异性结合的蛋白ATG3（图6）。有研究表明蛋白质的稳定性会受到泛素化依赖的蛋白酶体降解信号通路的调控，因此作者探究了SP100AS1是否通过泛素化依赖的蛋白酶体通路调控ATG3的稳定性。发现SP100AS1敲除增加了ATG3的泛素化水平从而介导ATG3的降解，表明SP100AS1通过泛素化介导ATG3的降解（图6）。上述结果表明了SP100AS1可以与ATG3特异互作来调控其蛋白稳定性。
　　图6SP100AS1与ATG3相互作用来调节其蛋白稳定性
　　7、SP100AS1可以与miR622靶向结合来发挥其调控作用
　　为了进一步研究SP100AS1调控ATG3表达的机制，作者观察了SP100AS1是否可以作为ATG3mRNA的miRNA海绵来发挥其调控作用。在HCT116和SW480细胞系中均检测到AGO2和SP100AS1互作，同时发现SP100AS1可以与miR622互作，且突变的SP100AS13‘UTR不能与miR622相互作用（图7）。以上结果表明SP100AS1可以作为miR622海绵发挥作用。证实了miR622可以直接与SP100AS1靶向结合，并影响其在CRC细胞中的mRNA稳定性。
　　图7SP100AS1作为miR622的海绵发挥作用
　　8、miR622靶向ATG3mRNA调节自噬
　　作者继续探究了miR622对自噬通路的影响。发现SP100AS1过表达后，p62的表达下调，LC3II的表达上调，而miR622过表达后则相反。在SP100AS1过表达的细胞系中异位表达miR622，可恢复p62和LC311的表达（图8）。因此作者猜测SP100AS1可以作为miR622的海绵，阻止其对ATG3mRNA的影响，从而稳定ATG3表达，促进自噬。为了验证这一猜想，进行了一系列试验。发现过表达miR622可以降低WT荧光素酶的表达，而与SP100AS1共转染则可以挽救荧光素酶的活性，且共转染携带突变的ATG33‘UTR区域的质粒并不能恢复荧光素酶活性。此外，miR622显著降低了ATG3的表达，而与SP100AS1共表达可以恢复ATG3的表达，敲除SP100AS1也可以降低ATG3中mRNA的水平（图8）。证实SP100AS1是CRC放疗抵抗的关键调控因子，作为miR622的海绵，维持ATG3的稳定表达。
　　图8SP100AS1通过与miR622相互作用调控ATG3的表达
　　研究结论
　　本研究通过全转录组测序分析，在放疗抵抗的CRC患者组织中找到表达上调的lncRNASP100AS1，敲除SP100AS1会显著降低体外和体内的放疗抵抗、细胞增殖和肿瘤形成。采用质谱和生信分析发现与SP100AS1互作的特异蛋白ATG3及miRNAmiR622。此外，研究发现SP100AS1通过泛素化依赖的蛋白酶体途径可以与ATG3蛋白互作并稳定其表达，同时还可以作为miR622的海绵，靶向ATG3mRNA，影响自噬活性。综上所述，本研究表明SP100AS1miR622ATG3调控CRC的放疗抵抗和自噬活性。
　　欢迎百度搜索欧易生物访问欧易生物官网了解全转录组测序技术
　　猜你想看
　　1、硕果累累31篇肿瘤领域单细胞客户文章大盘点之消化系统肿瘤领域合集！
　　2、Metabolism上海市五官科医院韦严团队发现表观遗传调节控制糖尿病视网膜病变进展的新机制
　　3、项目文章l四川农业大学研究团队发现Qc5等位基因提高小麦面包品质的调控机制
　　4、超干货万字长文，揭秘scATACseq分析全过程！
　　原创声明：本文由欧易生物（OEBIOTECH）学术团队报道，本文著作权归文章作者所有。欢迎个人转发及分享，未经作者的允许禁止转载