单细胞测序助力免疫分析同源或异源加强疫苗接种增强体液免疫基础

　　前言
　　2022年10月22日，复旦大学张文宏、姜宁、仇超及中国科学院分子细胞科学卓越创新中心许琛琦共同通讯于CellDiscovery（IF：38。079）在线发表了同源或异源加强疫苗增强SARSCoV2体液免疫的最新研究成果。
　　基本信息
　　期刊：CellDiscovery
　　影响因子：38。079
　　发表年月：20221022
　　材料：外周血，取自异源增强组BBIBPCorVZF2001和同源增强组BBIBPCorVBBIBPCorV接种前（D0）、接种后第3天（D3）、第14天（D14）、第90天（D90）、第180天（D180）的血液样本。
　　方法：10xGenomics单细胞5端测序、中和抗体检测、假病毒中和试验
　　研究结果
　　全球有超过5亿例COVID19病例，向世界卫生组织（WTO）报告的死亡病例有600万例，流感的控制已成为全球的主要任务。疫苗接种是控制COVID19流行的基础手段。在全球范围内，已经有数十亿剂新冠疫苗被接种。但是接种第二针疫苗57个月后，疫苗对抵抗COVID19的有效性会逐渐下降。研究发现，接种第三针同源异源疫苗可对COVID19进行有效防控。从当前的评估结果来看，异源加强疫苗比同源加强疫苗表现出更为显著的有效性。
　　接种疫苗后，免疫系统维持一种记忆能力，能够抵御病毒的侵染和病情的恶化。适应性免疫系统的记忆细胞和体内存在的抗体能够识别入侵抗原，并在再次识别时快速产生免疫反应，保证了免疫记忆的持久性。然而，近期研究发现在初级疫苗系列接种后，抗体滴度下降，因此提倡加强疫苗。当前，在接种加强疫苗之后，抗体对先前和目前流行的变种的持久性、强化激活的B细胞免疫的确切细胞过程以及记忆B细胞可以持续存在多长时间都是未知的。
　　众多5’端单细胞测序和V（D）J测序能够提供单细胞水平的细胞异质性和免疫系统多样性的图谱。在此之前，这种方法已被用于BNT162b2疫苗诱导的抗原特异性CD8T细胞应答。总之，scRNAseq和scV（D）Jseq有助于了解B和T细胞的克隆性、疫苗诱导的细胞表型和转录特征，对COVID19的干预有很大的帮助。在此，作者以两剂灭活疫苗为源头，研究了接种同源异源加强疫苗后适应性体液免疫反应的激活和记忆过程。利用单细胞免疫谱图，揭示了促进效应的细胞基础，强调了与抗体产生相关的关键代谢途径，为更高效、更持久的新一代SARSCoV2疫苗的开发提供了可能。
　　研究结果
　　Result1由异源或同源增强剂量诱导的中和抗体存在的持久性研究
　　作者进行了中和抗体存在的持久性分析，证明了同源BBIBPCorVBBIBPCorV或异源BBIBPCorVZF2001加强疫苗均可诱导抗RBD抗体的长期产生，且异源加强疫苗表现出更高的优势。作者采集D0、D14和D28患者的血液样本，进行假病毒中和试验（pVNT）。在第14天，接种同源BBIBPCorVBBIBPCorV或异源BBIBPCorVZF2001加强疫苗后的中和效度显著升高。两种加强疫苗都诱导了抗RBD抗体的长期产生，显示出与中和效度水平相似的轨迹。值得注意的是，异源组的pVNT值及抗体水平均是明显高于同源组的。随后，作者同其他已发表数据集比较了接种后6个月抗体下降水平，结果发现，在6个月时，接种异源BBIBPCorVZF2001疫苗后的受试者样本中保留的中和抗体活性最高，因此，异源加强疫苗在诱导可持续的体液免疫方面表现出一定的优势。
　　Result2外周血单细胞图谱分析
　　作者使用scRNAseq和scV（D）Jseq分析，揭示了同源和异源加强针诱导的早期和长期体液免疫的潜在机制。由于受试者在每次接种增强量后表现出很大的差异，作者选择了那些具有极高或极低的抗体滴度来研究抗体反应的细胞基础。在同源组（InaV）中，作者选择了中和抗体滴度为前14（InaVH组）的两个受试者；以及第3天（D3天）和第14天（D14天）（InaVL组）的中和抗体滴度为后14另外两名受试者。在异源组（PrSV）中，作者选择了中和抗体滴度为前14（PrSVH组）的四个受试者；以及第3天（D3天）和第14天（D14天）（PrSVL组）的中和抗体滴度为后14另外四名受试者。作者取未接种加强针（D0）、接种加强针后第3天、第14天、第90天、第180天的外周血单核细胞进行单细胞测序，共获得了454，202个单细胞转录组，中位基因数和UMI数分别为1465和3845，获得12种细胞类型。此外，还确定了六种主要的细胞类型：B细胞、T细胞、树突状细胞、单核细胞、自然杀伤细胞（NK）细胞和造血干细胞13。除了转录组分析外，作者还使用scBCRseq来研究B细胞免疫激活阶段的克隆扩增和记忆阶段的持久性。
　　Result3异源加强针比同源加强针诱导激活浆细胞的效应更强
　　作者通过细胞类型鉴定、基因富集分析、差异基因分析，证实了异源加强针比同源加强针诱导激活浆细胞的效应更强。作者鉴定出了3种主要的B细胞亚型：初始B细胞、记忆B细胞和浆细胞。浆细胞作为抗体分泌的主要来源，在接种加强针后表现出快速的克隆扩增，且异源加强组的浆母细胞克隆扩增比同源加强组出现得更早。同源组中扩增克隆的主要BCR同种型为IGHA2和IGHG2，异源组中克隆扩增的主要BCR同种型为IGHA1和IGHG1，揭示了不同加强针诱导的体液免疫的定性差异。与克隆扩增相一致的是，在异源加强组中，浆细胞发生增殖的时间也较早。根据基因本体论（GO）富集分析，异源加强组的浆细胞中与蛋白质翻译、折叠和糖基化相关的基因的表达量较高，线粒体中的氧化磷酸化也更为明显。差异表达基因分析结果显示，浆细胞在PrSV组对参与能量代谢途径的基因高表达，表明接种加强针后，PrSV组浆细胞生产和分泌抗体更活跃。这些结果是证实在异源组中有较高的抗体产生的现象的原因之一。
　　Result4B细胞克隆的早期扩增和持久性是抗体持续存在的基础
　　作者通过研究不同时间点B细胞亚型间BCR克隆的重叠情况、记忆B细胞的持久性、BCR克隆类型的差异，阐明了B细胞克隆的早期扩增和持久性是抗体持续存在的基础。作者在浆细胞中检测到的134个与疫苗相关的扩增克隆，其中17个与记忆B细胞的BCR重叠，表明sarscov2特异性记忆B细胞的重现。与新生克隆相比，被重现的克隆表现出更高的体细胞高突变频率（SHM）和同型转换，这表明，由被重现的克隆体产生的抗体可能具有更高的活性。作者在第3天和第14天检测到的1293个扩增记忆BCR克隆中，有380个能够在D90D180检测到，这表明B细胞具有良好的记忆持久性，并验证出他们来源的一致性。此外，作者还分析了InaV组和PrSV组之间BCR克隆类型的差异，在InaV组中发现1017个记忆克隆，911个新生克隆和159380个持久性克隆，在PrSV组中发现1517个记忆克隆，1011个新生克隆和233380个持久性克隆。通过以上结果，可以推测异源和同源加强针都能诱导抗原相关的B细胞激活和分化，并且SARSCoV2抗原特异性BCR克隆的存在至少持续180天。
　　Result5高抗体滴度与抗原呈递和滤泡辅助T细胞活化的活跃过程有关
　　作者将同源和异源增强受体重新分组为高抗体滴度和低抗体滴度组，分析了调节抗体反应的关键免疫途径。作者对抗原提呈细胞进行研究，发现传统树突状细胞（cDC）的抗原提呈活性与抗体滴度呈正相关。相反，浆细胞样树突状细胞（pDCs）或单核细胞的活性与抗体滴度呈负相关。cDC抗原呈递与抗体滴度的相关性仅在接种前具有显著性，这表明cDC起着关键作用。此外，在接种前，高抗体滴度组cDC中的toll样受体信号和细胞因子信号（TNF、IFN和IL1）更活跃，这可能是促进了cDC的激活。GOBP富集分析表明高抗体滴度组的cDCs的细胞活化、细胞粘附和抗原呈递更活跃。因此，基底cDC的激活和功能可能是触发增强剂诱导的抗体反应的关键。作者还发现在cDCs和B细胞之间，T细胞起着至关重要的桥接作用。在接受cdc的抗原刺激后，部分T细胞分化为滤泡辅助T（Tfh）细胞，这些细胞帮助B细胞分化为浆细胞和记忆细胞。在第14天时，高抗体滴度组中Tfh细胞的比例明显高于低抗体滴度组。GOBP富集分析进一步显示，D3D14高抗体滴度组Tfh细胞中基因的上调与病毒应答相关。细胞通讯分析表明，在D3D14和D90D180的高抗体滴度组中，cDCs、Tfh细胞和B细胞之间的联系更强，这表明SARSCoV2免疫的生物学过程在高抗体滴度组中更活跃。
　　Result6能量代谢促进抗体的产生
　　作者通过研究参与体液反应的免疫细胞能量代谢动力学，证实了抗体的生产高度依赖于能量的供应。结果显示，在所有类型的细胞中，cDC表现出最活跃的能量代谢，同时依赖糖酵解和氧化磷酸化两种代谢途径；Tfh细胞也同时依赖糖酵解和氧化磷酸化；记忆B细胞和浆细胞更多地依赖于氧化磷酸化，而不是糖酵解。在四种细胞类型中，谷氨酰胺分解途径均上调、脂肪酸氧化途径微小但显著的上调、糖酵解途径先上调后下调，谷氨酰胺似乎与抗体水平最具有相关性。磷酸戊糖途径（PPP）在cDC中高度活跃，而在其他类型的细胞中激活程度较低。在比较高抗体滴度组和低抗体滴度组时，作者发现高抗体滴度组的cDC的PPP在早期时间点更活跃。浆细胞参与己糖胺生物合成途径（HBP），记忆B细胞的HBP活性很小，浆细胞的HBP活性也与抗体滴度明显相关。作者对它们的营养摄取途径分析发现，谷氨酰胺是与抗体产生最相关的营养物质。
　　文章总结
　　SARSCoV2能够诱导很强的体液免疫反应，然而，它的细胞机制尚未明确。文章中，作者使用同源BBIBPCorVBBIBPCorV疫苗和异源BBIBPCorVZF2001疫苗，对其受体进行6个月的加强剂量的免疫，研究了抗体免疫应答的持久性，并绘制了单细胞免疫图谱。两种强化方案都显著地提高了中和抗体的产生，且能存活6个月。异源加强疫苗诱导了更快、更强的浆母细胞反应，浆母细胞的激活比同源加强疫苗更快。这种应答归因于记忆B细胞的回忆和B细胞的从头激活。B细胞克隆在接种加强针后可持续数月，并且他们的B细胞受体表现出积累突变。抗体的产生与传统树突细胞的抗原呈递成正相关，后者通过滤泡辅助性T细胞的激活和发育为B细胞的成熟提供支持。cDCTfhB细胞的正常激活可能是由于能量代谢驱动的，谷氨酰胺水解在体液免疫中可能也发挥重要的作用。本研究揭示了加强剂诱导的记忆适应性体液免疫的细胞机制，并提出了在未来迭代中优化疫苗有效性和持久性的潜在策略。
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　　（单细胞测序）
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