单细胞转录组测序解析抑制剂介导膀胱癌肿瘤微环境改变的作用机制

　　2020年10月8日，华中科技大学谌科教授团队于NatureCommunications（IF：17。694）在线发表了膀胱癌单细胞测序的相关研究成果。对8例膀胱癌肿瘤样本和3例配对癌旁样本进行了10xGenomics高通量单细胞转录组测序，绘制了膀胱癌肿瘤微环境细胞图谱。
　　该篇文章重点探讨了iCAFs的炎性作用，发现iCAFs亚群（inflammatorycancerassociatedfibroblasts）与临床预后和肿瘤生长增殖等密切相关。以上结果阐明了iCAFs的作用机理，对膀胱癌的治疗提供了新见解。该文章目前是ESI高被引论文，他引次数超过100次。
　　通过对以上单细胞测序数据的进一步挖掘，团队发现肿瘤来源的淋巴细胞中免疫检查点数量显著增加，进一步分析发现在这些免疫检查点中，CD39与膀胱癌进展显著相关。基于这一信息，团队进行了后续的深入研究。
　　2022年11月8日，华中科技大学该团队再次于Naturecommunications（IF17。694）上在线发表了膀胱癌单细胞测序揭示CD39i（CD39）抑制剂介导肿瘤微环境改变的最新研究成果。分别利用C57BL6J（batf3KO）小鼠和C57BL6小鼠作为实验动物，通过注射和灌注MB49细胞构建了膀胱癌皮下移植瘤模型和膀胱癌原位移植瘤模型。将以上小鼠模型随机分成1014只组，随后采用六种方案对各组小鼠进行腹腔内处理，结合单细胞测序绘制了不同处理组的膀胱癌肿瘤微环境细胞图谱，挖掘到CD39与膀胱癌的发展密切相关，并强调了CD39i在肿瘤治疗中的重要性。
　　该项目的单细胞转录组测序实验和分析结果展示了CD39i介导膀胱癌肿瘤微环境的改变，单细胞数据的进一步挖掘揭示了CD39i抗肿瘤的作用机制，该结果为膀胱癌患者的临床治疗提供了新的研究思路。
　　基本信息
　　期刊：Naturecommunications
　　影响因子：17。694
　　发表年月：2022年11月
　　材料：MB49细胞，C57BL6J（batf3KO）雄性小鼠，C57BL6雄性小鼠，NTPDase抑制剂多氧钨酸钠（POM1CD39i），单克隆抗小鼠NK1。1抗体，单克隆抗小鼠PD1（CD279）抗体，CIS，0。5CMCNa或PBS
　　方法：10xGenomics高通量单细胞转录组测序
　　研究背景
　　膀胱癌（BC）是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，世界范围内，膀胱癌发病率位居恶性肿瘤的第9位。近几十年来，局部肿瘤切除联合膀胱内BCG免疫治疗一直是NMIBC的一线治疗方法，但总体治疗效果一直不理想，仍有相当比例的患者疾病会复发。而基于CIS的化疗联合根治性膀胱切除术作为MIBC和晚期BC的治疗方案也并不令人满意。免疫检查点抑制剂是解决以上方案缺陷的一种新的治疗策略，已有几种PD1抑制剂和PDL1抑制剂被批准用于治疗MIBC，但该方案客观缓解率仅为1325，因此，迫切需要开发新的BC治疗靶点或联合治疗策略。
　　肿瘤微环境（TME）是潜在的BC治疗靶点，作者所在的团队之前通过对8个BC肿瘤样本和3个BC肿瘤样本进行单细胞RNA测序，揭示了肿瘤内部存在的高度异质性。基于对数据的进一步挖掘，发现肿瘤来源的淋巴细胞中免疫检查点数量显著增加，进一步分析发现在这些免疫检查点中，CD39与膀胱癌进展显著相关。本研究旨在利用单细胞测序深入探究CD39在膀胱癌发展过程中的相关性，后续采用不同的治疗手段进一步验证CD39i应用在临床治疗上的可行性，为临床中膀胱癌的有效免疫治疗提供新思路。
　　研究结果
　　Result1CD39在膀胱癌细胞BC中过表达，主要定位于肿瘤间质区，其表达水平与T细胞衰竭呈正相关
　　作者对之前发表的数据（来自BC患者的8个肿瘤样本和3个肿瘤旁样本）进一步挖掘，发现肿瘤来源的淋巴细胞中免疫检查点数量显著增加，进一步分析发现在这些免疫检查点中，CD39与膀胱癌进展显著相关（附图1B）。
　　8个BC和3个癌旁样本中的所有细胞通过tSNE降维聚类和经典的marker标记，被鉴定成10个主要的细胞类型，包括：上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和周细胞、成纤维细胞、髓样细胞、B细胞、T和NK细胞、肥大细胞、LYVE1细胞和浆细胞（图1A）。进一步探究CD39的分布，CD39主要表达于内皮细胞、SMC和周围髓细胞、纤维细胞和胶质细胞。对BC和癌旁组织进行免疫组化（IHC）染色，发现BC组织中CD39表达明显高于正常膀胱组织（P0。001），此外，CD39表达较高的BC患者预后较差（图1CE）。
　　作者发现肿瘤浸润的CD4T细胞和CD8T细胞均表达了较多的CD39，同时T细胞衰竭的标志LAG3表达量也有所增加（图1F，G），说明CD39表达水平与T细胞衰竭特征呈正相关，同时CD39的表达水平与耗竭CD8T细胞的比例呈正相关，这意味着CD39与T细胞的功能障碍也存在着一定相关性。
　　Result2CD39i在体内抑制BC发展
　　作者用POM1治疗小鼠皮下肿瘤模型和小鼠膀胱原位肿瘤模型，结果表明，CD39i能显著抑制肿瘤生长，提高小鼠存活率（图2AC）。在小鼠原位膀胱癌模型中，作者发现通过CD39i治疗可以显著降低肿瘤的最大横截面积和小鼠的膀胱重量，再次证明CD39i治疗可以显著抑制肿瘤生长（图2DG）。流式分析结果如图2HL所示，CD39i治疗显著增加了肿瘤组织中免疫细胞浸润，包括CD45细胞、CD4和CD8T细胞。为了了解CD39i治疗后肿瘤浸润免疫细胞的全景变化，我们从POM1和PBS处理组中分选CD45细胞，然后进行单细胞转录组测序。细胞分为了9种主要细胞类型，包括：T细胞、髓细胞、中性粒细胞、树突状细胞（DC）、NK细胞、B细胞、肥大细胞、Ctsk细胞和恶性细胞。结果表明CD39i和对照组之间CD45细胞的主要成分没有显著变化，仅观察到CD39i组中T细胞比例有轻微增加（图2M，N），表明CD39i可能会增加所有免疫细胞类型的丰度。
　　Result3CD39i激活了cDC1的增殖
　　作者进一步对DC进行亚群细分，分成了6个亚群，包括：迁移性DC2（mDC2）、迁移性DC1CD80（mDC1CD80）、cDC1、cDC1增殖型（cDC1p）、常规2型树突状细胞（cDC2）和浆细胞样DC（pDC）（图3AC）。与对照组相比，CD39i治疗肿瘤的DC亚群发生了显著变化，表现为mDC1CD80和pDC减少，cDC1和cDC1p比例显著增加（图3D）。尽管在CD39i处理后，DC亚群的比例发生了相对重塑，但作者没有观察到细胞亚群功能基因的显著变化（图3EG）。这些结果表明，CD39i只是促进了cDC1的扩增，增加了cDC1的比例，没有对DCs的功能造成明显影响。
　　Result4CD39i治疗激活了CD8T细胞，促进T细胞增殖
　　为了进一步研究CD39i介导的T细胞变化，淋巴细胞进一步降维聚类成10个簇，包括：CD8G2M、CD8S、CD8Slfn5、CD8TRM、CD8Ifitm1、NK、Th、CD4Pdcd1、Th17和Treg（图4AC）。作者发现CD39i引起了免疫细胞绝对数量的增加，其中循环CD8T细胞（CD8g2m和CD8s）的增加最为显著（图4D）。作者还观察到Treg丰度略有下降，NK细胞比例略有增加。随后，作者通过流式细胞术对NK细胞表型进行了分析，发现CD39i治疗显著增加了CD27CD11b和CD27CD11bNK细胞的比例，降低了CD27CD11b和CD27CD11bNK细胞比例，表明成熟NK细胞占比增大（图4E，F）。
　　此外，作者分析了不同CD8T细胞亚群的功能变化，结果表明，经CD39i处理后，循环CD8T细胞的常见组织标记物（Gzmk和Cd69）下调，而与一系列颗粒酶（Gzmb，Gzmc，Gzme，Gzmf）形成有关的eome和Prf1显著上调（图4G）。结合流式细胞术分析，作者发现CD39i治疗促进了T细胞增殖，并通过分泌更多的颗粒酶B和穿孔素增强了T细胞的肿瘤杀伤能力。综上所述，这些结果表明CD39i激活了细胞毒性T细胞并促进了这些细胞的增殖。
　　为了探究CD39i是否影响NK细胞、cDC1和T细胞之间的通信网络，作者构建了细胞细胞通信网络，发现cDC1和mDC1表达的Il15、Il12b、Cd80和Cd86，可能会与Il15ra、Il12rb12、Cd28相互作用，增强CD8T细胞的抗肿瘤活性（图4H）。之前的研究表明，分泌Il12b的mDC主要来源于cDC1，NK细胞可通过表达Xcl1与cDC1交流，募集cDC1趋向肿瘤细胞，而CD39i可通过增加肿瘤中的NK细胞来增强这一作用。总体而言，CD39i加强了NK细胞的浸润从而募集了更多的cDC1靶向肿瘤，cDC1通过表达Il15、Il12b、Cd80和Cd86来激活周期CD8T细胞，从而达到抗肿瘤作用（图4I）。
　　Result5NK细胞的衰竭逆转了CD39i在体内的抗肿瘤作用
　　为了验证CD39i对BC的潜在抑制机制，作者再次构建了小鼠皮下肿瘤模型，并将小鼠随机分为四组，分别用同型对照抗体CD39i、aNK1。1和CD39iaNK1。1。1处理（图5AC）。。与对照组相比，CD39i显著抑制了肿瘤生长并提高了小鼠的总体存活率（P0。0001），但在NK细胞缺失的小鼠中，CD39i的作用被显著逆转（P0。001）。此外，我们发现CD39i增加了对照小鼠中肿瘤浸润的cDC1的比例（图5D）以及肿瘤Xcl1蛋白水平，但在NK细胞缺失的小鼠中没有表现出这一现象。上述结果表明，NK细胞是CD39i发挥抗肿瘤作用的关键。
　　为了分析Batf3cdc1缺失对肿瘤微环境和CD39i疗效的影响，作者对经POM1或PBS处理的WT和Batf3小鼠进行了单细胞测序，所有细胞被聚集成10个cluster，包括：髓系细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞、树突状细胞（DCs）、NK细胞、肥大细胞、Ctsk细胞、基质细胞和上皮细胞（图6A，B）。作者发现CD39i引起了cDC1显著富集和扩增，而这种效应在Batf3模型中被完全阻断（图6C，D）。值得注意的是，在Batf3小鼠中mDCcDC2比值增加，推测Batf3可能会促进cDC2的成熟。
　　作者利用Marker基因，进一步将以上样本的淋巴细胞细分为CD4C01Tcm、CD4C02Th、CD4C03ThPD1、CD4C04Th17、CD4C05Treg、CD8C01TRM、CD8C02Ifit、CD8C03Tex、CD8C04Tex、cd8c05cycle、NKC01、NKC02c02、NKC03Gzmf、NKC04、nkc05cycle15个簇（图6F）。发现CD39i处理显著增加了增殖CD8T细胞和5种亚型NK细胞的比例，也提高了Batf3cDC1缺陷小鼠中NK细胞数量（图6G）。
　　Result6以CD39i为基础的联合治疗研究
　　体内实验表明，虽然单独应用CD39i或aPDL1抗体治疗小鼠，对其皮下肿瘤模型的生长和小鼠的存活率具有相似的治疗效果，但联合CD39i和aPDL1共同治疗并无产生协同作用（图7AC）。通过流式细胞术分析，我们发现CD39i处理显著减少了前体耗竭T细胞的数量，而aPD1被认为增强了前体耗竭T细胞的扩增，这可能削弱了它们协同作用。
　　接下来，作者尝试了CD39i、aPD1和CIS不同的组合策略。如图7DF所示，在联合策略中，CD39iCIS和aPD1CIS在抑制肿瘤生长和改善预后方面具有显著的协同作用。为进一步探讨CD39i与CIS联合的协同作用机制，作者应用流式细胞术分析不同计剂量的顺铂与CD39i的协同效果。作者发现剂量3mgkg的顺铂在增加肿瘤中cDC1的比例方面存在协同作用，但3mgkg和4mgkg顺铂的效果相同。进一步，我们发现3mgkg的顺铂与CD39i在增加肿瘤浸润cDC1的比例方面具有协同作用（图7G）。
　　考虑到顺铂会引起肿瘤细胞死亡释放大量的ATP，而使用CD39i可以抑制细胞外的退化ATP，作者推测两者结合的方案可能会进一步增加ATP在肿瘤微环境的积累，产生更强的抗肿瘤效应。CD39i或CD39i与aPD1联合可作为化疗后的后续治疗。
　　研究结论
　　单细胞测序技术显著提高了我们对膀胱癌（BC）基因图谱和分子特征的理解。作者通过单细胞转录组分析确定了CD39是BC的潜在治疗靶点。在皮下肿瘤模型和原位膀胱癌模型中，聚氧化锡酸钠（CD39i）对CD39的抑制能够限制BC的生长并提高患病小鼠的总体存活率。通过单细胞RNA测序，作者发现CD39i介导肿瘤微环境发生了变化，CD39i增加了肿瘤内NK细胞、cDC1和CD8T细胞的比例，并降低了Treg丰度。而NK细胞耗竭模型和cDC1缺陷模型均阻断了CD39i对肿瘤微环境的重编程，这意味着NK细胞是CD39i发挥抗肿瘤作用的关键。随后作者开展了以CD39i为基础的联合治疗，发现CD39i顺铂的联合治疗能产生协同效应，但CD39i抗PDL1没有显示出协同效应。本研究揭示了CD39是BD肿瘤微环境的作用靶点，基于CD39i的联合治疗方案为膀胱癌的治疗提供了新思路。
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