【中药研究】基于抗肝纤维化活性及近红外谱效相关的鳖甲质量评价

　　鳖甲来源于鳖科动物鳖TrionyxsinensisWiegmann的背甲，始载于《神农本草经》，在我国已有上千年的使用历史，中医认为其具有滋阴潜阳、退热除蒸、软坚散结等功效，临床用于治疗阴虚发热、劳热骨蒸、虚风内动、经闭、癥瘕等症〔12〕。既往系统生物学研究显示，鳖甲提取物具有抗纤维化、抗氧化及抗肿瘤等药理作用〔2〕。
　　临床研究也证实，以鳖甲为君药组方的鳖甲软肝片、鳖甲化纤方及鳖甲煎丸等复方中药具有显著减缓或逆转肝纤维化的临床疗效〔37〕，可见鳖甲在肝纤维化治疗领域具有广阔前景。
　　鳖甲在肝纤维化临床治疗中应用广泛，肝纤维化作为慢性肝脏疾病的结局，其中心环节是肝细胞损伤引起的肝星状细胞（HSCs）的激活〔11〕，正常情况下HSCs处于静止状态，产生少量细胞外基质（ECM）〔12〕，而激活的HSCs会产生大量的ECM，从而快速引起胶原化反应〔13〕。ECM主要由I型胶原（COL1）、IV型胶原等组成，COL1侧向排列形成的大量胶原纤维是肝纤维化的典型特征，也是肝纤维化严重程度评价的主要指标。转化生长因子1（TGF1）为肝纤维化模型的活化剂，可使HSC处于高活化状〔5〕。
　　全军中药研究所肖小河研究员等以鳖甲为模式药，以“源自临床，证于实验”为研究路径，从鳖甲的临床作用出发，基于TGF1诱导的人HSC细胞系LX2肝纤维化细胞模型，探索鳖甲水提物的抗肝纤维化生物活性；对鳖甲近红外光谱信息与抗肝纤维化生物活性进行相关性分析，建立关联活性的质量评价模式。
　　肝星状细胞的活化与增殖是肝纤维化的关键，本实验构建了TGF1诱导的LX2肝纤维化细胞模型，用于评价WECT的抗肝纤维化生物活性。
　　近红外光谱数据的预处理与相似度分析
　　10批鳖甲药材（S1～S10）的近红外光谱数据见图2A，OPUS7。5软件对近红外光谱数据进行一阶导数预处理见图2B。对经过一阶导数预处理的近红光谱数据进行相似度分析（表3），结果显示10批鳖甲药材的相似大于0。9，这表明10批鳖甲药材的近红外光谱信息的相似度高，提示单以近红外光谱数据难以实现鳖甲药材的质量评价。
　　不同批次的鳖甲药材抗肝纤维化生物活性的评价
　　在40、60、120、160、200、300mgmL生药质量浓度下测定WECT对肝纤维化模型细胞中COL1mRNA相对表达量的抑制率，计算得到EC50值为149。5mgmL，结果见图3A。据此，检测在生药质量浓度为150mgmL时10个批次WECT对TGF1诱导的肝纤维化模型细胞中COL1mRNA表达量的抑制率，评价不同批次鳖甲药材的抗肝纤维化生物活性，结果见图3B。
　　鳖甲药材效应近红外谱的建立与应用
　　对10批鳖甲药材的近红外光谱数据和鳖甲对TGF1诱导的肝纤维化模型细胞中COL1mRNA相对表达量的抑制率进行相关性分析，共筛选得到R0。6、P0。05，且波数大于8cm1的活性波段3个，分别为5226～5235cm1、5943～6071cm1与6379～6396cm1（图4A、B）。为进一步探究各活性波段与鳖甲药材抗肝纤维化生物活性的相关性，以各活性波段下面积为指标构建鳖甲药材的效应近红外谱（图4C），结果表明不同鳖甲药材的效应近红外谱之间存在一定的差异性。将各效应波谱下面积和作为鳖甲药材的质量评价系数，用于评价鳖甲药材的质量，结果表明鳖甲药材的抗肝纤维化活性与质量评价系数呈显著正相关（R0。88623，图4D）。
　　鳖甲药材效应近红外谱的验证
　　为进一步验证质量评价方法的科学性，本研究另取8批鳖甲药材（S11～S18），采集其近红外光谱信息并进行一阶导数处理，结果见图5A。测定其抗纤维化活性，结果见图5B。计算各特征波段下的面积，建立效应近红外光谱，见图5C。随后计算各批次药材的质量评价系数（质量评价系数SW1SW2SW3，SW1、SW2、SW3分别表示5226～5235cm1、5943～6071cm1与6379～6396cm13个波段下的面积和），并将各批次药材的质量评价系数与与其抗肝纤维化活性进行相关性分析（图5D），结果显示两者呈显著正相关（R0。81353），这表明基于鳖甲效应近红外谱构建的鳖甲质量评价系数能够较好评价鳖甲抗肝纤维化生物活性。
　　讨论
　　鳖甲在临床应用广泛，以鳖甲为君药的复方鳖甲软肝片对肝纤维化及早期肝硬化的疗效显著，是我国为数不多的用于治疗肝纤维化的药物〔14〕。近年来不少学者，基于生物评价建立了反映中药功效与毒性、中药制剂的一致性等的评价方法，但对于以鳖甲为例的药效物质尚不明确的动物药的质量评价研究较少〔15〕。因此关联生物活性的质量评价方法建立对于鳖甲的开发与利用有着重要意义〔16〕。
　　本研究以鳖甲为例，首先在细胞水平验证了鳖甲的抗肝纤维化生物活性，通过近红外光谱数据的分析与抗肝纤维化活性评价，建立了鳖甲效应近红外谱，并通过计算鳖甲的质量评价系数，实现了对鳖甲功效质量的评价，为鳖甲药材的开发与利用提供了有力保障，从而为鳖甲及动物药质量评价方法的建立或建全提供了新的线索。此外，基于效应近红外谱活性波段的鳖甲质量评价，是关联生物活性、操作相对简便的质量评价方法，可为其他动物药质量评价方法的建立或完善提供一定参考。
　　来源：曹梦珍，黄倩，牛明，赵旭，肖小河基于抗肝纤维化生物活性及近红外谱效相关的鳖甲质量评价研究〔J〕。中草药，2023，