染色质免疫共沉淀（ChIP检测）实验流程

　　染色质免疫共沉淀（ChromatinImmunoprecipitation），是检测转录因子等蛋白与DNA之间相互作用的主要实验方法之一。在活细胞内使用甲醛将DNA和蛋白交联，使用超声将染色质切成很小的片断，并沉淀下来。通过目的蛋白的抗体将蛋白免疫共沉淀，富集。通过定量PCR检测使用特异性引物对蛋白可能结合的DNA进行扩增检测。实验流程：1、细胞交联与超声破碎1将细胞培养在15cm培养皿中，待细胞长到70融合度时，根据实验目的进行细胞处理。培养到指定时间点后，去除培养基，加入预冷的PBS洗一次后将细胞消化下来后转移至15ml离心管中，1000rpm离心去除上清，加入5mlPBS缓冲液，加入甲醛至终浓度为1，室温置于摇床上轻轻晃动20min。加入2。5MGlycine至终浓度0。125M终止交联。在4下轻轻晃动10min。在100g，4离心5min。弃上清，加入10ml预冷的PBS洗两次，离心去除上清。2加入2mlcellLysisBuffer（含2。5l蛋白酶抑制剂）重悬细胞。冰上孵育15min，每隔5min振荡一下细胞悬液。孵育之后，用Dounce匀浆器将细胞悬液匀浆化10次以促进核释放。34800g离心5min。去除上清，用0。5mlNuclearLysisBuffer（含2。5l蛋白酶抑制剂）重悬细胞。4超声破碎：使用超声仪在中档，冲击13s，冰上放置45s，共6次。取5l细胞裂解液进行电泳检测未打断的DNA。5412000rpm离心10min除去不溶解的沉淀。将上清液转移至心的EP管中，分为50l一份。2、免疫共沉淀1每个IP实验需要450lDilutionBuffer和2。25l蛋白酶抑制剂。测试样品包括：阳性对照AntiHistoneH3，阴性对照NormalRabbitIgG，目的抗体。2超声好的50l样本置于冰上，加入450l稀释液（含2。25l蛋白酶抑制剂），轻轻混匀后，去除5l冻存，作为input。3分别加入不同抗体和20l混匀的proteinAmagneticbeads。阳性对照抗体，4。0g抗体每管。阴性对照IgG，5。0g抗体每管。目的抗体，每管加5。0g抗体。44旋转孵育过夜。5使用磁力架将ProteinAmagneticbeads沉淀下来，轻轻去除上清。6加入0。5ml预冷的缓冲液，在旋转台上孵育5min后置于磁力架上，去除上清。7低盐清洗缓冲液、高盐清洗缓冲液、LiCl清洗缓冲液、TE缓冲液分别洗1次，每次5min。将样本置于磁力架上，去除上清。8洗脱ProteinDNA复合物和反交联ProteinDNA复合物为单独的DNA。9加入100lChIP清洗缓冲液，62振荡孵育2h1095孵育10min。然后将样品置于室温冷却。11将样本置于磁力架上，将上清液移到一个新的管子中。3、DNA纯化1将0。5mlBindReagentA加入每个100l的DNA样品管中并混匀。将样本转移至离心柱上管中，12000rpm离心1min。去除下管液体。2加入0。5mlWashReagent至离心柱上管中，12000rpm离心1min。去除下管液体。312000rpm离心2min。丢弃下管。将上管置于新的管中，在离心柱上加入50lElutionbuffer，常温放置2min，12000rpm离心1min。4去除离心柱，下管加入20l洗脱液就是纯化的DNA，直接用于定了PCR检测或存于20。4、定量PCR检测1使用紫外分光光度计检测纯化DNA含量
　　2PCR体系：
　　试剂体积
　　DNA2L
　　PCR上游引物（10M）0。4L
　　PCR下游引物（10M）0。4L
　　SYBRGreensolution10L
　　灭菌双蒸水7。2L
　　总量20L
　　3定量PCR检测
　　反应条件：
　　95。010min
　　95。015s40cycles
　　60。01min
　　95。015smeltcurve
　　60。01min
　　95。015s
　　实验结果示例：
　　图ChIP检测结果示例图
　　AChIP检测DNA跑胶示例图。BChIP检测结果分析示例图。CChIP检测扩增曲线示例图。DChIP检测溶解曲线示例图。