CRISPR方法无需病毒载体即可提高效率和产量

　　新开发的CRISPR系统使用结合了Cas9靶序列的单链DNA（ssDNA）HDR模板（HDRT），相对于dsDNA，敲入效率和产量提高了两到三倍。此外，这种不依赖病毒载体的方法允许科学家将特别长的DNA序列引入细胞基因组中的精确位置。
　　这项工作发表在NatureBiotechnology上的论文使用混合ssDNA修复模板和小分子鸡尾酒在原代细胞中进行高产基因组工程。
　　多年来，我们的目标之一是以不依赖病毒载体的方式将冗长的DNA指令放入基因组中的目标位点，格莱斯顿加州大学旧金山分校研究所所长AlexMarson医学博士说基因组免疫学。这是朝着下一代安全有效的细胞疗法迈出的一大步。
　　Marson和他的同事们不仅描述了这项技术，而且展示了它如何用于产生具有抗多发性骨髓瘤（一种血癌）潜力的CART细胞，以及重写基因序列，其中突变可能导致罕见的遗传性免疫疾病。
　　我们表明，我们可以在一次运行中设计超过10亿个细胞，这远高于我们治疗个体患者所需的细胞数量，Marson实验室临床研究员、医学博士BrianShy说。
　　使用病毒载体既昂贵又耗费资源，Shy说。基因工程非病毒方法的一个主要好处是我们不受成本、制造复杂性和供应链挑战的限制。
　　使用具有Cas9靶序列的高浓度双链DNA（dsDNA）来提高CRISPR介导的插入效率可能对原代细胞有毒。即使在相对较高的浓度下，单链DNA对细胞的毒性也较小。在新方法中，研究人员描述了一种将修饰的Cas9酶连接到单链模板DNA的方法，方法是在末端添加一小段双链DNA突出端。
　　这为我们提供了一种平衡的、两全其美的方法，Marson说。
　　与旧的双链方法相比，单链模板DNA可以将基因编辑效率提高一倍以上。分子的双链末端让研究人员可以使用Cas9来增强非病毒载体向细胞的传递。
　　这项技术有可能使新的细胞和基因疗法更快、更好、更便宜，加州大学旧金山分校实验室医学助理教授兼Gladstone附属研究员JonathanEsensten医学博士说。
　　在这项研究中，研究人员使用新的DNA模板生成了超过10亿个针对多发性骨髓瘤的CART细胞。大约一半的T细胞获得了新基因，并因此转化为CART细胞。
　　我们知道，将DNA模板靶向基因组中的特定位置，称为TRAC位点，将提高CART细胞的抗肿瘤效力，血液学部医学助理教授JustinEyquem博士说加州大学旧金山分校的肿瘤学和格莱斯顿的附属研究员。这种新的非病毒方法使我们能够更有效地实现这一目标，这将加速下一代CART细胞疗法的开发。
　　此外，研究人员表明，他们的方法首次可以完全替换与罕见遗传免疫疾病相关的两个基因，即IL2RA和CTLA4基因。
　　过去，科学家们已经证明他们可以替换特定患者发生突变的IL2RA基因的一小部分。现在，Marson的团队证明他们可以一次替换整个IL2RA和CTLA4基因一种一刀切的方法，可以治疗这些基因中具有不同突变的许多患者，而不必为每个患者的突变生成个性化模板。用这种基因工程方法处理的近90的细胞获得了健康版本的基因。
　　研究人员现在正在寻求批准在CART细胞治疗和IL2RA缺乏症治疗中使用非病毒CRISPR技术推进临床试验。