浙江大学运用非靶向代谢组学转录组学揭示镉暴露与糖尿病的关联热

　　前言
　　镉是一种广泛存在于环境中的有毒重金属，广泛存在于环境中。慢性和低剂量Cd暴露与循环毒性、肾损伤、中枢和外周神经毒性、肺部疾病、角化过度和皮肤棘皮症有关。此外，镉化合物作为已鉴定的致癌物也参与了人类肺癌、前列腺癌和肾癌的发病机制。流行病学研究表明，尿镉含量与空腹血糖受损显著相关。然而，镉暴露胰腺细胞代谢毒性特征与潜在的分子事件及机制尚不清楚。
　　2022年03月，浙江大学公共卫生学院周舟团队在环境科学顶刊《EnvironmentInternational》杂志发表题为“Cadmiumperturbedmetabolomicsignatureinpancreaticbetacellscorrelateswithdisturbedmetaboliteprofileinhumanurine”（IF13。352）的研究成果，通过采用转录组，非靶向代谢组学等技术，首次揭示了镉诱导的代谢紊乱在胰岛细胞功能障碍中的重要作用，强调了从人群水平控制镉暴露降低糖尿病发病风险的重要性。
　　研究思路
　　胰腺细胞功能障碍是糖尿病发病机制中的关键事件。葡萄糖及其代谢物、脂质分子及其代谢物协同调节胰腺细胞功能。脂毒性代谢物通过诱导细胞氧化应激、内质网对胰腺细胞中的胰岛素产生和分泌产生不利影响（ER）压力和线粒体损伤。因此，阐明代谢紊乱和脂毒性代谢物在Cd诱导的胰腺细胞功能障碍中的作用非常重要。Cd暴露是否以及如何扰乱线粒体TCA循环并产生脂毒性代谢物对于了解Cd暴露的代谢毒性至关重要。
　　本研究的目的是揭示胰腺细胞中Cd暴露的代谢组学特征，从而为了解Cd诱导的与胰腺细胞损伤和糖尿病发病机制相关的代谢毒性提供全代谢组水平的新证据。
　　研究思路
　　研究结果
　　1、镉暴露在体内和体外造成胰腺细胞功能障碍
　　为了测试镉暴露对胰腺细胞功能的毒性作用，作者首先检测了镉暴露后小鼠的血糖水平（图1A）。此外，作者进行了腹腔内葡萄糖耐量试验以测量胰腺细胞功能（图1BC）。通过HE染色观察Cd暴露小鼠胰岛的形态学损伤（如图1D所示）。通过免疫荧光染色用于特异性标记胰腺细胞和细胞。发现在镉暴露后分泌胰岛素的细胞显著减少，而胰高血糖素分泌细胞没有改变（图1E）。
　　为了进一步验证Cd暴露是否在体外诱导胰腺细胞功能障碍，作者在体外测量了CdCl2对MIN6细胞的毒性作用（图1FG）。同时检查镉暴露对MIN6细胞胰岛素分泌的剂量和时间影响（图1H所示）。在Cd暴露后24小时，MIN6细胞分泌的胰岛素含量显著降低。在一项时程研究中，观察到胰岛素分泌的减少早在Cd暴露后3小时就发生了（图1I）。综上所述，这些在体内和体外数据表明，镉暴露会导致葡萄糖耐受不良、胰岛受损、抑制胰腺细胞胰岛素分泌。
　　图1Cd暴露抑制C57BL6小鼠和MIN6细胞中的胰岛素分泌
　　2、Cd暴露改变了MIN6细胞的代谢组学特征
　　为了探索MIN6细胞中Cd暴露在代谢组水平上的代谢毒性，作者对暴露后24小时的MIN6细胞进行了基于LCMSMS的代谢组学分析。主成分分析（PCA）显示对照组和Cd处理组之间存在显著差异（图2A），表明Cd暴露导致细胞代谢组学谱发生显著变化。Cd暴露导致由正ESI模式确定的MIN6细胞中的显著代谢破坏（图2乙）。OPLSDA计算模型的质量良好（图2C）。火山图显示了调整后的p值与代谢物强度相对于Cd暴露的倍数变化（FC）幅度之间的关系（图2D）。这些结果清楚地表明，镉暴露显著改变了MIN6细胞中的代谢组学特征。
　　图2Cd暴露改变了MIN6细胞中的代谢物谱
　　3、Cd扰动代谢物的亚细胞定位
　　细胞器之间代谢物的动态相互作用是协调细胞内代谢平衡的重要机制。为了揭示Cd暴露显著改变的代谢物的细胞内区室，作者进一步分析了MIN6细胞中受扰动的代谢物的亚细胞分布。发现扰动的代谢物广泛分布在细胞质和细胞器中（图3A）。作者进一步分析了这些位于线粒体的代谢物的化学超类组成。发现核苷、核苷酸和类似物占线粒体代谢物的大部分（图3B）。在分层聚类分析的热图中观察到28种线粒体代谢物的两个不同的差异，如图3所示C，表明线粒体代谢受到镉暴露的显著干扰。在这28种代谢物中，26种代谢物显著增加，而2种代谢物（DL2氨基己二酸、甜菜碱）显著增加减少。
　　细胞内细胞器之间代谢通量的动态串扰调节细胞功能。细胞器中受干扰的代谢物会破坏代谢通量和细胞器相互作用。因此，作者通过维恩图分析进一步剖析了位于线粒体、溶酶体和ER中的改变代谢物的组成（图3D）。鉴于线粒体是细胞氧化应激的关键调节剂，而过氧化物酶体被认为是脂质和氧化还原信号网络中的关键枢纽，因此使用维恩图分析了线粒体和过氧化物酶体中受到干扰的代谢物。作者发现线粒体和过氧化物酶体中均存在9种改变的代谢物（图3E），这表明线粒体功能和氧化应激可能会受到Cd暴露的代谢毒性的干扰。
　　图3Cd暴露在MIN6细胞中扰动代谢物的细胞定位
　　4、Cd暴露扰乱了代谢途径和升高的脂毒性代谢物
　　为了揭示MIN6细胞中Cd暴露干扰的显著差异的代谢途径，作者通过KEGG分析表示差异显著性的p值和反映受影响途径影响严重程度的差异表达代谢物的数量（如图4所示），结果表明Cd暴露会导致MIN6细胞出现整体代谢紊乱。线粒体TCA循环、甘油磷脂代谢、胆碱代谢、嘧啶代谢、丙氨酸天冬氨酸谷氨酸代谢等代谢途径均受到明显干扰。
　　为了进一步描述脂毒性代谢物与线粒体代谢物之间的关系，作者进行了Pearson相关分析。相关网络表明脂毒性代谢物与线粒体代谢物密切相关（图4C）。这些结果支持线粒体作为镉暴露代谢毒性的主要靶细胞器。
　　图4Cd暴露会扰乱代谢途径并提高MIN6细胞中的脂毒性代谢物
　　5、Cd暴露在线粒体TCA循环和相关脂肪酸氧化中的基因表达失调
　　为了验证Cd暴露对线粒体TCA循环和相关脂肪酸氧化的毒性作用，作者运用转录组测序检测了Cd暴露后MIN6细胞和小鼠胰腺中调节线粒体TCA循环和相关脂肪酸氧化的基因的mRNA表达。如图5A，在MIN6细胞（图5A）和小鼠胰腺（图5A）中，Idh3b、Ogdh和EtfdhmRNA表达显著下调，Mdh2、EtfamRNA表达显著上调。Cd暴露后。这些数据表明Cd暴露会失调线粒体TCA循环中的基因表达。
　　在验证Cd暴露对脂肪酸氧化的影响时，作者检测了脂肪酸氧化的关键调节因子Fa2h、Pycr1和Hsd17b10基因的mRNA表达。发现Fa2h和Pycr1在MIN6细胞和小鼠胰腺中mRNA表达显著下调（图5BD）。总之，这些结果进一步表明，镉暴露通过失调基因表达损害线粒体TCA循环和相关的脂肪酸氧化。
　　图5Cd暴露使MIN6细胞和小鼠胰腺中与线粒体TCA循环和脂肪酸代谢相关基因的mRNA表达失调
　　6、尿中Cd扰动代谢物的鉴定
　　为了探索在MIN6细胞中鉴定出的扰动代谢物是否与人类接触Cd的代谢毒性相关，作者首先在人样本进行了非靶向代谢组学分析以鉴定Cd扰动的尿代谢物，然后评估与糖尿病发病机制的相关性。对比分析了15名高浓度镉暴露工人和15名健康人的尿液样本（样本策略）。主成分分析（PCA）的得分图显示健康受试者和Cd暴露工人之间存在显著差异（图6A），表明Cd暴露导致尿液中代谢物谱发生显著变化。Cd暴露导致尿液中的代谢物显著扰动（图6B）。
　　在Cd暴露工人的尿液中共鉴定出53种受干扰的代谢物。作者选择前20个受扰动的代谢物进行ROC曲线，用于评估作为Cd毒性生物标志物的特异性和敏感性。代谢途径富集显示34种代谢途径受到人类Cd暴露的显著干扰（图6D）。
　　为了测试受扰动的代谢物是否可以反映线粒体代谢的紊乱，作者发现线粒体代谢特征被显著破坏。线粒体中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、柠檬酸循环、胰高血糖素信号通路、ABC转运蛋白和硫胺素代谢的层次聚类受到干扰（图6F）。这些结果表明，Cd对线粒体代谢的毒性可以通过尿液中的代谢物紊乱来指示。
　　图6血清LCMS代谢组学分析及其与蛋白质组学的相关性
　　7、血脂代谢组学分析结果及其与蛋白质组学的相关性
　　首先，作者检查了Cd扰乱胰腺细胞中的代谢物是否共存于Cd暴露工人的尿液中。结果显示，14种受干扰的代谢物共存于Cd暴露的MIN6细胞和Cd暴露工人的尿液中（图7A）。在细胞和人体尿液样本中这14种重叠代谢物中，12种在Cd暴露工人的尿液中显著增加，2种显著减少。
　　尿液中受干扰的代谢物已被认为是预测和诊断糖尿病的代谢组学生物标志物。接下来，作者从暴露于Cd的工人中受扰动的代谢物中筛选出作为糖尿病代谢组学生物标志物的尿液代谢物。与对照组相比，Cd暴露工人尿液中11种糖尿病代谢组学生物标志物的丰度显著改变（图7B）。Veen图显示，人尿中11个代谢组学生物标志物有3个重叠代谢物，细胞和人尿样品中有14个共存代谢物（图7C）。最后，作者检查了3种重叠代谢物作为Cd暴露代谢毒性生物标志物的特异性和敏感性。进行ROC曲线。L谷氨酰胺（0。751）、硫胺素（0。960）和牛磺酸（0。849）在95置信区间内的AUC值表明这3种代谢物具有良好的预测性能（图7DF）。
　　总之，这些结果表明，在全代谢组水平的MIN6细胞中鉴定出的扰动代谢物与人类接触镉的代谢毒性密切相关。尿液中的L谷氨酰胺、硫胺素和牛磺酸可用于预测和监测Cd诱导的人类代谢紊乱。
　　图7胰腺细胞中受干扰的代谢物与糖尿病相关的尿代谢生物标志物的相关性
　　8、绘制Cd暴露对TCA循环和甘油磷脂代谢的破坏性影响
　　为了解释显著扰动的代谢物与代谢途径之间的关系，作者根据扰动的代谢物数据和在MIN6细胞和小鼠胰腺中的验证，绘制了图8中Cd暴露对线粒体TCA循环和甘油磷脂代谢的破坏性影响。Cd暴露扰乱了TCA循环代谢物，显著增加糖酵解糖异生和牛磺酸代谢的紊乱。此外，还发现甘油磷脂代谢的代谢产物的增加，鞘脂代谢代谢物的减少。总之，镉诱导的线粒体TCA循环和甘油磷脂代谢紊乱可能是胰腺细胞功能障碍的潜在机制。
　　图8胰腺细胞中受干扰的代谢物与糖尿病相关的尿代谢生物标志物的相关性
　　相关讨论
　　由于环境因素和遗传脆弱性，糖尿病的风险被认为是频率上升的。作为环境中最危险的因素之一，Cd被发现在肝脏和胰腺中积聚，在那里它对碳水化合物代谢产生有害影响并破坏葡萄糖稳态。镉暴露还会通过改变和损害相关的关键酶活性来干扰糖酵解、糖生成和糖异生过程，失调激素平衡，如胰岛素、糖皮质激素和胰腺和肾上腺中的儿茶酚胺。此外，镉暴露增强了活性氧的产生并抑制了多个器官之间的抗氧化防御机制。尽管大量研究支持镉诱导的代谢紊乱与糖尿病发病率之间的关联，但这种代谢毒性的确切机制仍然未知。
　　在作者的研究中，将基于LCMSMS的非靶向代谢组学分析应用于Cd暴露的MIN6细胞，以深入了解代谢组水平的代谢变化。证明了与环境相关的Cd暴露改变了MIN6细胞中的代谢组学特征，这些数据表明，受扰动的代谢物可能直接损害这些细胞器的功能并且细胞器之间的代谢相互作用受到干扰。此外，Cd暴露导致脂毒性代谢物强度显著增加。KEGG通路分析显著揭示了Cd暴露破坏了以线粒体TCA循环和甘油磷脂代谢紊乱为特征的代谢平衡。据作者所知，这是第一项描述胰腺细胞中镉毒性的代谢组学特征并将代谢组学特征与镉诱导的人体代谢毒性相关联的研究。
　　流行病学研究已经建立了镉暴露与糖尿病之间的直接联系。Cd毒性对糖脂代谢的确切机制尚未阐明。由于胰腺细胞是体内产生和分泌胰岛素的唯一来源，揭示胰腺细胞中全代谢组水平的Cd诱导的代谢紊乱对于了解Cd暴露与糖尿病风险增加之间的关系具有重要意义。从这个意义上说，结合生物信息学分析的非靶向代谢组学的应用可能是揭示镉诱导的胰腺细胞代谢毒性特征的有力策略。代谢组学的主要价值在于它测量代谢物并确定在短时间内整合基因表达和环境调节的途径，以揭示系统的新兴特性。
　　在作者目前的研究中，作者证明Cd暴露会诱导小鼠葡萄糖升高和不耐受，并抑制胰腺细胞胰岛素的产生。在作者的体外研究中，当MIN6细胞用与环境相关的Cd暴露，胰岛素分泌明显受到抑制。代谢组学分析分别鉴定了76种显著扰动的代谢物。这些受干扰的代谢物影响胰腺细胞功能的潜在机制需要进一步研究。
　　由于Cd暴露会导致TCA循环和受扰动的代谢物表明的甘油磷脂代谢的扰动，作者确定了与这些代谢过程相关的酶的基因表达的变化。在镉暴露后，在MIN6细胞和小鼠胰腺中，TCA循环相关基因，脂质代谢相关基因紊乱。因此，作者目前的研究结果支持Cd诱导的酶失调导致TCA循环和甘油磷脂代谢紊乱的推测。
　　因此，作者提出的新发现对于全面了解环境相关Cd暴露的代谢毒性和确定早期医疗干预的分子靶点具有非常宝贵的价值。
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　　本研究中的代谢组学分析不仅在胰腺细胞中进行，而且在Cd暴露工人的尿液样本中进行。细胞代谢组学的结果揭示了与环境相关的Cd暴露如何在整个代谢组水平上发挥代谢毒性。尽管人类尿液代谢物的变化不一定反映胰腺细胞功能障碍，但尿液中存在扰动的代谢物为将镉暴露的代谢毒性与人类健康风险联系起来提供了直接证据。揭示了阐明受干扰的代谢物和代谢途径与镉暴露相关糖尿病发病机制的动态作用。
　　作者首先进行了体内研究，以研究镉诱导的小鼠血糖水平、血清胰岛素水平、葡萄糖耐量和胰腺胰岛素产生的变化。为了剖析Cd毒性的代谢组学特征，作者使用体外Cd暴露的胰岛素分泌细胞和来自Cd暴露工人的尿液样本，通过非靶向代谢组学探索代谢组范围内的变化。通过超高效液相色谱串联质谱（LCMSMS）测定代谢物强度和变化特征。作者分析了改变代谢物的细胞内位置，确定了脂毒性代谢物并描绘了Cd干扰的代谢途径。镉暴露工人尿液中的代谢组学变化进一步证实了镉在胰腺细胞中诱导的代谢毒性。本研究的结果提高了作者对胰腺细胞和人类全代谢组水平上镉诱导的代谢毒性的理解。本篇文章是一篇思路非常清晰的代谢组转录组文章，值得深入研读。
　　浙江大学公共卫生学院博士洪慧慧为论文第一作者，浙江大学公共卫生学院周舟研究员、医学院附属第一医院急诊科陆远强教授和陆军军医大学皮会丰教授为论文的共同通讯作者。
　　该研究受到了国家自然科学基金、教育部电磁辐射医学防护重点实验室开放课题以及浙江省重点实验室建设基金的支持。
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